Rapid Analysis of Cyclosporine A, Everolimus, Sirolimus, and Tacrolimus Drugs in Whole Blood Using an Agilent Triple Quadrupole LC/MS/MS System with Automated Online Sample Cleanup

Význam tématu

Stanovení koncentrací imunosupresivních léčiv v krevním vzorku je klíčové pro terapeutické monitorování pacientů po transplantaci a pro zajištění účinnosti a bezpečnosti léčby. Rychlé, citlivé a selektivní analýzy umožňují včas detekovat suboptimální nebo toxické hladiny a přispívají k lepší péči o pacienty.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout vysoce výkonnou LC–MS/MS metodu s automatizovaným online čištěním vzorku pro simultánní kvantifikaci cyklosporinu A, everolimu, sirolimu a takrolimu v plné krvi. Metoda má dobu analýzy 2 minuty na Agilent 1260 LC systému spojeném s Agilent 6460/6470 Triple Quadrupole MS se zdrojem JetStream.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy:

• Proteinová precipitace: 100 µL krve + 200 µL roztoku ZnSO₄:methanol (1:4) obsahující deuterované interní standardy.
• Vortex 30 s, centrifugace 10 000 rpm/4 min, transfer supernatantu do autosamplerového vialu.

LC konfigurace a parametry:

• Trapping kolona: ZORBAX Eclipse Plus C18, 2.1×12.5 mm, 5 µm.
• Analytická kolona: Poroshell 120 EC-C18, 3×50 mm, 2.7 µm.
• Teplota kolony 60 °C, objem injekce 40 µL, běh 2 min.
• Online čištění: dva binární pumpy s 2-polohovým 6-port ventilem, odplach na odpad a následné eluce analyzátů na analytickou kolonu.

MS/MS parametry:

• Agilent 6460/6470 QqQ se zdrojem JetStream, pozitivní ionizace.
• MRM přechody pro každý analýt a odpovídající interní standardy.
• Lineární rozsahy: CsA 1,95–2000 ng/mL, Eve/Sir/Tac 0,10–100 ng/mL, R² > 0,995.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala vynikající linearitu a selektivitu. Kalibrační křivky zahrnovaly 11 úrovní s koeficienty determinace nad 0,997. Robustnost byla ověřena 13 sériemi stres-testů (celkem až 14 495 injekcí) na obou MS přístrojích, kdy CV pro plochy signálů zůstal pod 10 %. Přesnost a opakovatelnost hodnocená BioRad QC vzorky (14denní studie, 4 operátoři) ukázala průměrnou odchylku 95–105 % a CV do 14 %.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlý 2-minutový běh s minimální přípravou vzorku a online čištěním výrazně snižuje vliv matrice a iontové potlačení. Metoda je vhodná pro vysoce propustné laboratoře klinického monitorování, kde je klíčová rychlost a přesnost diagnózy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další imunosupresiva a biologické matice (plazma, séra). Integrace s plně automatizovanými systémy a novými generacemi hmotnostních spectrometrů zvýší throughput a umožní komplexnější terapeutické monitorování.

Závěr

Vyvinutá metoda kombinuje jednoduchou preparaci, automatizované online čištění a rychlou LC–MS/MS analýzu, což poskytuje spolehlivé, přesné a vysoce propustné kvantifikace klíčových imunosupresiv v plné krvi.

Reference

• Côté L., Joseph S., Menon S., McCann K. Rapid Analysis of Cyclosporine A, Everolimus, Sirolimus, and Tacrolimus Drugs in Whole Blood Using an Agilent Triple Quadrupole LC/MS/MS System with Automated Online Sample Cleanup. Application Note 5991-3344EN. Agilent Technologies, 2015.