Multi-Angle Light Scattering goes micro

Význam tématu

Multi Angle Light Scattering (MALS) představuje přesnou a absolutní metodu stanovení molární hmotnosti a rozměru makromolekul bez nutnosti kalibračních standardů. V praxi se využívá zejména v kombinaci s chromatografickými technikami (SEC/GPC, UHPLC), kde rozšiřuje možnosti charakterizace polymerů, proteinů a konjugátů. S nástupem UHPLC se objevily výzvy spojené s sekundárním rozšiřováním pásu, což vyvolalo potřebu vývoje nových detektorů a korekčních postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předložené studie je demonstrovat integraci detektorů µDAWN (MALS) a UT-rEX (differential refractive index) s UHPLC-SEC, prokázat minimalizaci pásového rozšiřování a validovat metodu na vzorcích proteinů, včetně BSA, monoklonálních protilátek a konjugátů protilátka-léčivo (ADC). Studie rovněž popisuje vývoj konstrukčních úprav detektorů a aplikaci softwarových korektivních mechanismů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty bylo použito:

• UHPLC systém Waters Acquity se sloupci BEH200 (1,7 µm, 4,6×150/300 mm)
• MALS detektor Wyatt µDAWN s upravenou optikou a sníženým objemem buňky (10 µL)
• UV detektor Waters Ti TUV
• dRI detektor Wyatt UT-rEX s objemem rozšiřování pásu <4 µL
• Software ASTRA 6.1.2 pro vyhodnocení molární hmotnosti, rozměru a korekce pásového rozšiřování
• Mobilní fáze: fosfátový pufr (PBS), průtok 0,3 mL/min

Hlavní výsledky a diskuse

Nasazení µDAWN a UT-rEX s UHPLC vedlo k výrazně užším eluačním pásům oproti konvenční SEC-MALS. Po aplikaci korekce sekundárního rozšiřování pásu bylo dosaženo konzistentních hodnot molární hmotnosti pro BSA (≈66–68 kDa) a další referenční proteiny. Metoda umožnila identifikaci fragmentů IgG v rozsahu 27–142 kDa a přesné stanovení poměru lék–protilátka (DAR) u ADC s chybou <2%. Užitelnost UV korekce a odečtů dRI přinesla robustní určení konformačních vlastností a stability makromolekul.

Přínosy a praktické využití metody

Nasazením UHPLC-SEC-MALS/dRI se laboratoře v oblasti vývoje biologik a polymerů mohou spolehnout na:

• Rychlé a přesné stanovení molární hmotnosti bez kalibrace
• Možnost analýzy nízko koncentrovaných vzorků (20 ng BSA)
• Detailní charakterizaci konjugátů protilátka–léčivo a stanovení DAR
• Analýzu konformace a větvení polymerů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování vývoje zahrnuje rozšíření UHPLC-SEC-MALS na APC sloupce pro širší rozsah separačních podmínek, vylepšení softwarových algoritmů pro korekci rozšiřování pásu a integraci s dalšími detekčními modalitami (např. viskometrie in-line). Očekává se rozvoj kompaktních modulárních detektorů pro online aplikace v QA/QC a rychlé screeningové analýzy.

Závěr

Studie demonstrovala úspěšné propojení UHPLC s MALS a dRI detekcí pomocí přístrojů µDAWN a UT-rEX. Díky sníženému objemu detekčních buněk a pokročilým korekčním postupům bylo dosaženo vysoké přesnosti stanovení molární hmotnosti i pro složité biologické vzorky. Metoda má široké uplatnění ve vývoji biologických léčiv, polymerní chemii a QA/QC analytice.

Reference

• Astafieva A., Eberlein G., Nilsson L., Shortt D.W., Wyatt P.J. Multimeric conformation multiangle laser light scattering and reversed-phase high-performance liquid Chromatography. American Laboratory, 1995.