Using Hydrophilic Interaction Chromatography for Heightened Product Characterization to Overcome Challenges with Hydrophobic Monoclonal Antibodies and Antibody Drug Conjugates

Význam tématu

Hydrofobní povaha subjednotek monoklonálních protilátek (mAb) a konjugátů protilátka-léčivo (ADC) často komplikuje jejich kompletní chromatografickou obnovu v běžné reverzní fázi (RPLC). Vývoj metod, které umožní šetrnější separaci a minimalizují termickou degradaci či artefakty, je klíčový pro přesnou charakterizaci bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo porovnat nový širokopórový amido-stacionární fázový materiál v režimu hydrofobně interakční chromatografie (HILIC) s konvenční RPLC pro analýzu subjednotek mAb a ADC. Studie zahrnovala enzymatický rozklad protilátek pomocí IdeS, redukci disulfidů a následné separace s UV a MS detekcí.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300 Å, 1,7 µm (2,1×150 mm)
• ACQUITY UPLC Protein BEH C4 300 Å, 1,7 µm (2,1×100 mm a 2,1×150 mm)
• ACQUITY UPLC H-Class a H-Class Bio System
• UV detektor při 214 nm
• Ultravysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie pro online identifikace

Použitá metodika

Monoklonální protilátky i ADC byly inkubovány s IdeS enzymem při 37 °C pro specifický rozklad v oblasti závěsu, následovala denaturace 8 M guanidinem a redukce 1 M DTT. Pro RPLC i HILIC byly optimalizovány gradienty s TFA jako ionizačním pomocníkem a kontrolou teplot od 30 do 80 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

• HILIC umožnila kvantitativní obnovu všech tří subjednotek mAb i ADC při výrazně nižší závislosti na teplotě než RPLC.
• V režimu HILIC se neobjevily artefakty hydrolytické degradace pozorované v RPLC při teplotách nad 65 °C.
• Reverzní pořadí elučních časů odráželo komplementární retenci oproti RPLC a umožnilo detailní rozlišení glykoform Fc domény.
• Pro ADC subjednotky HILIC zachovala stejnou celkovou účinnost obnovy i po navázání cytotoxického ligandového nákladu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená spolehlivost a reprodukovatelnost analýzy mAb/ADC subjednotek v QPCR a výzkumu.
• Nižší teplotní podmínky snižují riziko degradace a artefaktů.
• Komplementární zaměření RPLC a HILIC rozšiřuje možnosti charakterizace a validace bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj širokopórových HILIC fází a jejich integrace s hmotnostní spektrometrií pro hlubší rozlišení glykoform a dalších posttranslačních modifikací. Metoda může být rozšířena na nové třídy proteinových léčiv a automatizované platformy pro vysokopropustné analýzy.

Závěr

HILIC s širokopórovou amido stacionární fází představuje perspektivní alternativu k RPLC pro separaci a charakterizaci subjednotek mAb a ADC. Nabízí vyšší návratnost hydrofobních komponent, nižší teplotní závislost a minimalizaci artefaktů, což výrazně zlepšuje kvalitu a spolehlivost analytických profilů.

Reference

• 1. An Y., Zhang Y., Mueller H.M., Shameem M., Chen X. MAbs 2014, 6(4):879–893.
• 2. Renkin E.M. J. Gen. Physiol. 1954, 38:225.
• 3. Lauber M.A., Koza S.M. Waters App. Note 720005385EN, 2015.
• 4. Lauber M.A., Koza S.M. Waters App. Note 720005380EN, 2015.
• 5. Lauber M.A., Koza S.M. Waters App. Note 720005409EN, 2015.
• 6. Fekete S., Beck A., Wagner E., Vuignier K., Guillarme D. J. Sep. Sci. 2015, 38(1):1–8.
• 7. Alpert A.J. J. Chromatogr. 1990, 499:177–196.
• 8. McNay J.L., Fernandez E.J. J. Chrom. A 1999, 849(1):135–148.
• 9. Oxford Notation for Glycans (GOF, G1F, G2F).
• 10. Casi G., Neri D. J. Med. Chem. 2015, 58(22):8751–8761.
• 11. Shen W.-C. In Antibody-Drug Conjugates: The 21st Century Magic Bullets for Cancer, Shen W.-C. a kol., ed. 2015.