Enhancing Subunit-Level Profiling of mAbs and ADCs with MS- Quality Difluoroacetic Acid

Význam tématu

Profilování subjednotek monoklonálních protilátek (mAb) a protilátka-lék konjugátů (ADC) je zásadní pro detailní charakterizaci variant, modifikací a obsazenosti léčivou zátěží. Vysoká citlivost a rozlišovací schopnost LC-MS metod umožňuje přesnější kontrolu kvality, výzkumné studie i vývoj nových biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout novou platformu pro LC-MS profilování subjednotek mAb a ADC založenou na vysoce čisté difluoroctové kyselině (DFA) vhodné pro MS a na inovativní BioResolve RP mAb Polyphenyl koloně. Studie řeší nedostatek komerčně dostupné MS-kvalitní DFA a optimalizuje chromatografické a hmotnostně spektrometrické podmínky pro dosažení vyšší rozlišení, citlivosti a robustnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Redukovaný a IdeS‐digestovaný NIST mAb Subunit Standard
• Hydrofobní cystein-vázaný ADC od Pfizeru

Chromatografie:

• BioResolve RP mAb Polyphenyl (2,1×150 mm, 2,7 μm, 450 Å)
• ACQUITY BEH C4 (2,1×150 mm, 1,7 μm, 300 Å)
• Mobilní fáze A: voda + 0,1–0,15 % DFA/TFA/FA; fáze B: ACN nebo ACN/IPA (90/10)
• Gradient 15–55 % B během 20 min, průtok 0,2–0,6 mL/min, teplota 70–80 °C

Hmotnostní spektrometrie:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio s TUV detektorem
• Xevo G2-XS QToF v režimu citlivosti
• Software MassLynx 4.1, UNIFI 1.8, dekonvoluce MaxEnt

DFA čištění:

• Vícenásobná destilace k odstranění kovových nečistot, ověřeno ICP-MS

Hlavní výsledky a diskuse

• DFA vs. TFA: použití 0,1–0,15 % DFA vedlo k 4× vyšší MS citlivosti a jemnějšímu iontovému párování než TFA.
• DFA po destilaci dosáhla kovových nečistot pod 20 ppb, srovnatelně jako komerční FA/TFA.
• Optimalizovaná MS nastavení minimalizovala kovové addukty a zlepšila kvalitativní čtení hmotnostních spekter.
• BioResolve Polyphenyl kolona zlepšila rozlišení subjednotek mAb i ADC při nižších teplotách a bez přídavku IPA.
• Metoda vykázala robustnost s RSD <6 % pro jednotlivé parametry (teplota, průtok, hmotnost nálože, koncentrace DFA) a stabilitu až 1000 injekcí.
• Průměrná hodnota DAR konjugátu byla reprodukovatelná (4,2) a analýza oxidovaných či aglykozylovaných subjednotek byla výrazně citlivější.

Přínosy a praktické využití metody

Nová platforma přináší následující výhody:

• Vyšší rozlišení a citlivost pro QC/QA biologických léčiv
• Přesnější detekci PTM a heterogenit mAb/ADC
• Vyšší průchodnost analýz při zachování jemné selektivity
• Snížení teploty provozu a potřeby agresivních aditiv

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření DFA-kompatibilních metod na peptidy, fúzní proteiny a další biologika
• Integrace do plně automatizovaných pracovních postupů ve farmaceutickém výzkumu
• Další optimalizace iontových párů a ekologičtější chemie mobilních fází
• Využití v top-down a nativní MS pro komplexní strukturální charakterizaci

Závěr

Práce představuje úspěšné vyvinutí nové platformy pro LC-MS profilování subjednotek mAb a ADC založené na vysoce čisté DFA a špičkové BioResolve RP mAb Polyphenyl koloně. Metoda nabízí výrazně vyšší citlivost, rozlišení a robustnost, což otevírá nové možnosti pro detailní charakterizaci biologických léčiv.

Reference

• Smith J., Friese O., Rouse J., Nguyen J., Lauber M., Jayaraman P. Characterization of Hydrophobic Monoclonal Antibodies and Antibody Drug Conjugates. WCBP 2018, Washington D.C., USA.
• Nguyen J. M., Rzewuski S., Walsh D., Cook D., Izzo G., DeLoffi M., Lauber M. A. Designing a New Particle Technology for Reversed Phase Separations of Proteins. Waters Application Note 720006168EN, 2018.
• Fekete S., Veuthey J., Guillarme D. New trends in reversed-phase liquid chromatographic separations of therapeutic peptides and proteins: Theory and applications. J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 69, 9–27.
• Nguyen J. M., Kizekai L., Walsh D., Cook J., Lauber M. A. A Novel Phenyl Bonded Phase for Improved Reversed-Phase Separations of Proteins. Waters Application Note 720006169EN, 2018.