Increasing Throughput for the Analysis of Human Insulin and Related Biotherapeutic Analogs using the ionKey/MS System

Význam tématu

Insulin a jeho bioterapeutické analogy jsou základními léčivy pro pacienty s diabetem závislým na inzulínu. S rostoucím počtem pacientů s diabetem 2. typu a vývojem nových biosimilárních forem insulinu je nezbytné mít analytické metody, které zajistí vysokou citlivost, přesnost a efektivní průchodnost v bioanalytických laboratořích. Microflow LC-MS s ionKey/MS System poskytuje optimální řešení pro rychlou a citlivou kvantifikaci těchto peptidových léků při nízkém objemu vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zvýšit průchodnost metody mikroprůtokové LC-MS analýzy lidského insulinu a pěti komerčních analogů (detemir, glulisine, lispro, glargine, aspart) při zachování citlivosti na úrovni jednotek desítek pg/mL. Dále bylo porovnáno zkrácení doby analýzy a udržení analytických výkonů při použití standardního iKey (150 µm) a nového iKey HT (300 µm) Separation Device.

Použitá instrumentace

• ionKey/MS System kombinující ACQUITY UPLC M-Class System s Xevo TQ-XS Mass Spectrometer
• Separační zařízení iKey HT 300 µm × 50 mm, BEH C18 1,7 µm
• Trap kolona Symmetry C18 300 µm × 50 mm, 5 µm
• Oasis MAX µElution 96-well SPE deska pro přípravu plazmatických vzorků

Použitá metodika

Vzorky lidské plazmy byly ošetřeny precipitací bílkovin a extrakcí pomocí Oasis MAX µElution SPE protokolu. Eluát byl naředěn a naložen na trap kolonu v poměru mobilní fáze A/B 85:15 při 25 µl/min po dobu 2 minut. Následovala analytická separace gradientem 15–55 % organické fáze B během 2 minut, návrat na výchozí podmínky a reekvilibrace, při průtoku 6 µl/min, teplotách kolony 75 °C a vzorku 12 °C, s injekcí 15 µl a celkovým dobou běhu 7 minut. Detekce probíhala v režimu MRM se stanovenými přechody, hodnotami kuželového napětí a kolizní energie pro každý analog i interní standard (bovinní insulin).

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky v rozsahu 25–10 000 pg/mL vykázaly lineární vztah s R² > 0,99 (1/x vážená regrese). Dolní hranice kvantifikace se pohybovaly mezi 25 a 100 pg/mL s přesností nad 93 %. Nové zařízení iKey HT (300 µm) dosáhlo doby analýzy 7 minut, což představuje dvojnásobné zrychlení oproti standardnímu 150 µm iKey (13,5 min) a 1,7× rychlejší průběh než konvenční 2,1 mm UPLC metoda (8 min) při minimálním snížení citlivosti.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace iKey HT nabízí bioanalytickým laboratořím:

• Vyšší průchodnost s kratší dobou analýzy
• Udržení vysoké citlivosti a přesnosti kvantifikace
• Snížení množství spotřebovaného vzorku a reagencií
• Jednodušší obsluhu díky integrované ultramikrofluidické konstrukci

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na rozšíření aplikací pro jiné proteinové a peptidové terapie, automatizaci přípravy vzorků v mikroformatu a další zkracování doby analýzy. Technologie ionKey/MS umožní modulární přepínání mezi ultra-senzitivními a vysoce propustnými režimy, což podpoří náročné bioanalytické úkoly v oblasti terapeutických proteinů.

Závěr

Studie prokázala, že ionKey/MS System ve spojení s iKey HT (300 µm) separačním zařízením výrazně zvyšuje průchodnost mikroprůtokové LC-MS analýzy insulinu a jeho analogů při zachování citlivosti v pg/mL oblasti. Tato vysoce výkonná a flexibilní platforma přináší praktické výhody pro bioanalytická centra zaměřená na vývoj a kontrolu bioterapeutik.

Reference

1. E.E. Chambers et al. Multidimensional LC-MS/MS Enables Simultaneous Quantification of Intact Human Insulin and 5 Recombinant Analogs. Analytical Chemistry, 86(1), 694–702 (2014).
2. M. Donegan et al. High Throughput Microflow LC-MS: Sensitivity Gains on a Practical Timescale. Waters White Paper, 720005765EN (2016).
3. E.E. Chambers et al. Reducing Sample Volume and Increasing Sensitivity for the Quantification of Human Insulin and 5 Analogs in Human Plasma using ionKey/MS. Waters Application Note, 720005119EN (2016).
4. Y.W. Alelyunas et al. High Throughput Analysis at Microscale: Performance of ionKey/MS with Xevo G2-XS QTof Under Rapid Gradient Conditions. J. Appl. Bioanal., 1(4), 128–135 (2015).
5. P.D. Rainville et al. Integration of Microfluidic LC with HRMS for the Analysis of Analytes in Biofluids: Past, Present, and Future. Bioanalysis, 7(11), 1397–1411 (2015).