LC-MS: OBJEKTIVNÍ METODA DIAGNOSTIKY INTOXIKACÍ MUCHOMŮRKAMI

Význam tématu

Intoxikace houbami rodu Amanita, zejména muskarinem z muchomůrky červené a amatoxiny z muchomůrky zelené, představují v klinické praxi závažný problém. Konvenční mikroskopické metody jsou subjektivní, časově náročné a vyžadují zkušeného specialistu. Zavedení cílené, citlivé a objektivní analýzy pomocí LC-MS umožňuje rychlou diagnostiku a sledování intoxikovaných pacientů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat jednotný postup pro extrakci muskarinu, α-amanitinu, β-amanitinu, faloidinu a falacidinu z biologických vzorků (moč, sérum, žaludeční a střevní obsah) a následně stanovit tyto toxiny pomocí kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (LC-MS). Metodu autoři aplikovali na reálných klinických případech intoxikací muchomůrkami.

Použitá metodika a instrumentace

Extrahované vzorky byly ošetřeny SPE na kolonách Strata X-CW s elucí kyselinou mravenčí v methanolu. Analýza LC-MS probíhala na přístroji Shimadzu LC-MS 2010A (ESI, kvadrupól) s autosamplerem SIL-HT a termostatovaným kolonním systémem. Pro separaci muskarinu byla použita kolona Gemini C18 (150×2,0 mm, 5 µm) s mobilní fází 8 mmol l–1 heptafluoromáselné kyseliny a acetonitrilem. Pro amatoxiny a faloidy kolona Synergi Polar RP (100×2,0 mm, 2,5 µm) s mobilem octan amonný 0,1 mol l–1 + 0,1 % kyseliny mravenčí a acetonitrilem. Gradientní eluce, průtok 0,2 ml/min, teplota kolony 30–35 °C, napětí kapiláry ESI 2–4,5 kV, teplota vyhřívané kapiláry 240–250 °C, sušící plyn dusík 1,5 l/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda pro muskarin vykázala lineární kalibrační křivku v rozmezí 0,0003–2,0 µg/ml (R2=0,9993), LOD 0,09 ng/ml, LOQ 0,3 ng/ml a výtěžnost 95 %. Pro α- a β-amanitin byl rozsah 0,002–10,0 µg/ml (R2>0,993), LOD 0,6 ng/ml, LOQ 2,0 ng/ml, výtěžnost 93–96 %. Preciznost (RSD) do 8,3 % a přesnost (rel. chyba) do ±10 %. Metoda byla ověřena na dvou klinických případech: v prvním odhalení muskarinu v moči a žaludečním obsahu u dospělého pacienta po požití „magic mushrooms“, v druhém detekce amatoxinů a faloidinu ve střevním obsahu a appendixu u dítěte.

Přínosy a praktické využití metody

Tato LC-MS metoda přináší objektivní, citlivou a specifickou diagnostiku mykotoxinových otrav. Umožňuje kvantifikovat toxiny v různých biologických matricích a nahradit časově náročné mikroskopické vyšetření, čímž zlepšuje rychlost a spolehlivost toxikologické diagnostiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace LC-MS metod do rutinní praxe může být podpořena automatizací extrakce, využitím vysokorozlišovací MS pro potvrzení struktur, rozšířením spektra detekovaných toxinů a kombinací s dalšími hyphenovanými technikami (LC-HRMS, LC-MS/MS). Důležitá je také tvorba databází hmotnostních spekter pro rychlou identifikaci nových mykotoxinů.

Závěr

Vyvinutá a validovaná LC-MS metoda poskytuje spolehlivý nástroj pro stanovení muskarinu a amatoxinů v klinických vzorcích. Je dostatečně citlivá, přesná a robustní, vhodná pro řízenou diagnostiku houbových otrav a podporuje objektivní a rychlá rozhodnutí v medicínské praxi.

Reference

1. Laux H. E.: Jedlé houby a jejich jedovatí dvojníci. Víkend, Český Těšín 2006.
2. Merová B., Ondra P., Staňková M., Válka I.: Neuroendocrinol. Lett. 29, 744 (2008).
3. Schonwald S. v knize Medical toxicology (Dart R. C., ed.), kap. 257. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia 2004.
4. Jahodář L. v knize Přírodní toxiny a jedy (Houdek L., ed.), kap. 5,3. Galén, Praha 2004.
5. Michelot D., Melendez-Howell L. M.: Mycol. Res. 107, 131 (2003).
6. Satora L. et al.: Toxicon 45, 941 (2005).
7. Herink J. et al.: Toxické poškození ledvin houbami. Maxdorf, Praha 2004.
8. Wieland T.: Int. J. Pept. Protein Res. 22, 257 (1983).
9. Faulstich H., Münter K.: Klin. Wochenschr. 64, 66 (1986).
10. Pastorello L., Tolentino D.: J. Chromatogr. 233, 398 (1982).
11. Belliardo F., Massano G.: J. Liq. Chromatogr. 6, 551 (1983).
12. Caccialanza G., Gandini C., Ponci R.: J. Pharm. Biomed. Anal. 3, 179 (1985).
13. Jehl F. et al.: Anal. Biochem. 149, 35 (1985).
14. Homann J. et al.: Arch. Toxicol. 59, 190 (1986).
15. Brüggemann O., Meder M., Freitag R.: J. Chromatogr., A 744, 167 (1996).
16. Defendenti C. et al.: Forensic Sci. Int. 92, 59 (1998).
17. Maurer H. H. et al.: J. Chromatogr., B 748, 125 (2000).
18. Butera R. et al.: Clin. Toxicol. 42, 901 (2004).
19. Filigenzi M. S. et al.: J. Agric. Food Chem. 55, 2784 (2007).
20. Merová B. et al.: J. Chromatogr., B, v tisku (2012).