ELEKTROCHEMICKÉ STANOVENÍ TOXICKÉHO INDOXYL SULFÁTU V BIOLOGICKÉ MATRICI

Význam tématu

Indoxyl sulfát představuje významný uremický toxin vznikající z metabolismu tryptofanu střevními bakteriemi a následnou sulfatizací v játrech. Vzhledem k jeho silné vazbě na proteiny a obtížné odstranitelnosti běžnou dialýzou se jeho kumulace v krvi spojuje s progresí chronického onemocnění ledvin, kardiovaskulárními komplikacemi, oxidačním stresem a dalšími patologickými stavy.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo optimalizovat, validovat a akreditovat analytickou metodu pro kvantitativní stanovení indoxyl sulfátu ve vzorcích lidské moči a krevního séra. Studie zahrnovala přípravu vzorků, výběr chromatografických podmínek, elektrochemické detekce a následnou validaci metodiky podle akreditačních požadavků.

Použitá instrumentace

• HPLC UltiMate 3000 Series (Thermo Fisher Scientific)
• Coulometrický elektrochemický detektor ECD-3000RS s porézní grafitovou pracovní elektrodou a palladiovou referentní elektrodou
• Detektor diodového pole DAD-3000RS
• Kapitální váhy XS205DU (Mettler-Toledo)
• Ultrazvuková lázeň Sonorex Super RK 510
• Centrifuga Sigma 3-16KL s chlazením

Použitá metodika

Pro stanovení indoxyl sulfátu v moči byla použita metoda HPLC/ED-DAD s C18 kolonou Zorbax SB-C18 (250×4,6 mm, 5 μm), mobilní fází fosfátový pufr pH 7,3 s EDTA a iontově párovým činidlem a methanol v poměru 95:5 při průtoku 0,4 ml/min. Kreatinin v moči byl stanoven spektrofotometricky po Jaffého reakci s kyselinou pikrovou. Serum bylo připraveno precipitací bílkovin kyselinou chloristou a analyzováno na koloně Kinetex XB-C18 (100×4,6 mm, 5 μm) s mobilní fází pH 4,2 (fosfátový pufr, EDTA, iontově párové činidlo) a methanolem 85:15 při průtoku 0,3 ml/min.
Validace zahrnovala stanovení opakovatelnosti, opakovatelnosti metody, správnosti, lineární rozsah, LOD, LOQ a robustnosti vůči změnám klíčových parametrů. Metody byly akreditovány ČIA.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda pro moč dosahuje LOD 0,014 mg/l a LOQ 0,021 mg/l, lineární rozsah 1–85 mg/l (R2=0,9942). Opakovatelnost 4,9 %, opakovatelnost metody 8,0 % (fyziologická hladina). U séra LOD 0,37 mg/l, LOQ 0,56 mg/l, kvadratická kalibrace v rozsahu 1–110 mg/l (R2=0,9993). Robustnost byla potvrzena u všech testovaných faktorů.
Analýza reálných vzorků ukázala, že vyšší příjem bílkovin koreluje se zvýšeným vylučováním indoxyl sulfátu močí. U dialyzovaných pacientů se koncentrace IS před a po hemodialýze většinou nesnížila na polovinu, v některých případech se hodnoty dokonce zvýšily kvůli koncentraci bílkovin v krevním séru.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a spolehlivé stanovení indoxyl sulfátu v moči i séru
• Možnost monitorování pacientů s chronickým onemocněním ledvin a hodnocení účinnosti dialýzy
• Využití v klinické praxi i výzkumných laboratořích díky nízkým provozním nákladům oproti MS detekci

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj elektrochemických detektorů pro zvýšení citlivosti a selektivity
• Využití nanomodifikovaných uhlíkových elektrod pro snížení meze detekce
• Implementace metodiky do automatizovaných systémů pro kontinuální monitoring pacientů

Závěr

Vyvinuté a akreditované metody HPLC/ED-DAD představují efektivní nástroj pro kvantifikaci indoxyl sulfátu v biologických matricích. Díky ověřené validaci lze spolehlivě sledovat hladiny tohoto uremického toxinu, hodnotit riziko jeho kumulace a optimalizovat léčbu pacientů s poruchou funkce ledvin.

Reference

1. Filik H., Kilcan D.: J Anal Chem 69 255 2014
2. Niwa T.: Nagoya J Med Sci 72 1 2010
3. Matouš B.: Základy lékařské chemie a biochemie Galén Praha 2010
4. Leong S C., Sirich T L.: Toxins 8 358 2016
5. Hyšpler R. et al.: Dis Markers 2018 3985861
6. Marzocco S. et al.: Blood Purif 35 196 2013
7. Niwa T.: Uremic Toxins Wiley Hoboken 2012
8. Makrlíková A. et al.: Chem Listy 112 605 2018
9. Yoshikawa D. et al.: Circ J 78 2477 2014
10. Zhang L S., Davies S S.: Genome Med 8 46 2016
11. Cassani E. et al.: Parkinsonism Relat Disord 21 389 2015
12. Poesen R., Meijers B., Evenepoel P.: Semin Dialysis 26 323 2013
13. Hou Y C., Lu C L., Lu K C.: Nephrology 23 88 2018
14. Akiyama K. et al.: Int J Endocrinol 2018 6
15. Vaarmann A., Kask A., Mäeorg U.: J Chromatogr B 769 145 2002
16. Filik H., Avan A A., Aydar S.: Curr Pharm Anal 12 36 2016
17. Dvořák P., Vyskočil V.: Chem Listy 113 703 2019
18. Xu H. et al.: Anal Chim Acta 577 207 2006
19. Bergerová M. et al.: Curr Anal Chem 14 530 2018
20. Jaffe M.: Z Physiol Chem 10 391 1886
21. Davidsohn I., Henry J B.: Clinical Diagnosis by Laboratory Methods Saunders Philadelphia 1963