Integrating Ion Mobility into Routine Drug Metabolite Identification Studies Using the Vion IMS QTof Mass Spectrometer

Význam tématu

Identifikace a charakterizace metabolit léčiv je klíčová pro pochopení biologických biotransformačních drah a hodnocení bezpečnosti nových léčiv. V komplexních vzorcích (tkáně, tělní tekutiny) se často objevují izobarické sloučeniny, jejichž rozlišení vyžaduje kromě hmotnostní přesnosti také informační vrstvu o tvaru molekul. Zavedení iontové mobility (IMS) do rutinních LC–MS experimentů poskytuje dodatečný rozměr pro rozlišení izomerů a čištění spekter.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat jednoduché, plně integrované workflow pro rutinní identifikaci metabolitů pomocí Vion IMS QTof hmotnostního spektrometru a softwaru UNIFI. Studie využila data independent režim HDMSE k monitoringu a dekonvoluci koelutujících metabolitů nefazodonu a buspironu připravených v hepatocytových inkubacích a prokázala robustnost měření kolizní plochy (CCS) jako identifikačního parametru.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky

• Inkubace 10 µM nefazodonu a buspironu s kryoprezervovanými potkaními hepatocyty při 37 °C v časech 0–240 minut.
• Ukídka acetonitrilem, centrifugace a analýza supernatantu; pro test v složitém matrice ředění 1:10 v moči.

Chromatografie

• Systém Waters ACQUITY UPLC I-Class (FTN) s kolonkou HSS T3 (2,1×100 mm, 1,8 µm).
• Gradient 10min: voda+0,1 % FA vs. acetonitril+0,1 % FA, průtok 0,6 ml/min, teploty kolony 45 °C, vzorku 6 °C.
• Objem injekce 0,1–10 µl, délky metod 5, 10 a 15 minut.

Hmotová spektrometrie

• Vion IMS QTof, ESI+, datový režim HDMSE (0,1 s scan time), zdroj 120 °C, desolvační 450 °C, plyn 800 l/h, kapilára 1 kV, kónus 40 V.
• Kalibrace a zpracování dat v UNIFI s automatickým výpočtem CCS vůči standardům (leucin­enkephalin m/z 556,27658).

Hlavní výsledky a diskuse

Iontová mobilita výrazně zlepšila čistotu spekt­er díky časově (tR) i driftově (dt) zarovnaným fragmentům. Příklad dihydroxylovaného glukuronidu buspironu ukázal odstranění pozadí z moči a hepatocytů a jasnou identifikaci fragmentů.
Filtrované chromatogramy XIC s výběrem dt zvýšily poměr signál/šum trojnásobně u nefazodonu, což umožnilo detekci nízkoabundantních metabolitů i při 100× ředění.
Hodnoty CCS zůstaly konstantní napříč koncentracemi a matricemi (%RSD 0,2 %) a umožnily sledovat nefazodon v časové ose inkubace i pod různými gradienty (5/10/15 min).
Iontová mobilita dekonvolvovala koelutující metabolity: hydroxylované a dihydroxylované glukuronidy nefazodonu (CCS 220,95 a 261,30 Å2) a tři metabolity buspironu (dihydroxylace, hydroxylace, desaturace+hydroxylace), čímž zabránila nesprávným přiřazením transformací.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatické měření CCS zvyšuje spolehlivost a opakovatelnost identifikace.
• Rozlišení izomerů a koelutujících látek bez nutnosti složité postprocessingové dekonvoluce.
• Zkrácení doby zpracování a zvýšení průchodnosti laboratoře.
• Možnost aplikace v rané fázi výzkumu, preklinickém testování i rutinní QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Přenositelnost CCS mezi laboratořemi a budování rozsáhlých IMS–CCS databází umožní rychlou dereplikaci a automatizaci identifikace metabolit. Kombinace s vysoce rychlou chromatografií, radiolabelingem a dalšími separačními technikami podpoří komplexní metabolomické studie a průmyslové nasazení vysoce výkonných screeningových platforem.

Závěr

Integrace iontové mobility do datově nezávislého režimu HDMSE na Vion IMS QTof v prostředí UNIFI přináší vysoce čistá spektra, spolehlivé CCS jako identifikační klíč a robustní rozlišení izobarických a koelutujících metabolit. Tato technologie snižuje manuální zásahy, zkracuje dobu analýzy a zvyšuje důvěryhodnost výsledků v metabolitové identifikaci.

Reference

1. Wrona M., Naughton S., Alelyunas Y., Mortishire-Smith R., Kirk J. Metabolite Identification Solution: Working with Large Preclinical Multispecies Data Sets. Waters Application Note 720006106EN, October 2017.
2. Holdsworth C., Clayton R., Robinson H., Lord-Mears C., Kendrick J. Utilization of Ion Mobility Enabled Collision Cross Section Measurements for a Comparison of Metabolites Across Differing Chromatographic Methods. Poster DMDG 2016.
3. Clayton R., Holdsworth C., Tomczyk N., Plamer M., Hewitt D., Weston D. Resolution and Characterization of Co-eluting Metabolites by Collision Cross Section Measurements Using a Novel Geometry Travelling Wave IMS QTof Mass Spectrometer. Poster ASMS 2016.