Metabolite Identification: Working with Large Preclinical Multispecies Data Sets

Význam tématu

Metabolitická identifikace představuje klíčovou součást vývoje nových léčiv a studií farmakokinetiky (DMPK).
Umožňuje pochopit, jak je léčivo přeměňováno v organismu, odhalit potenciálně toxické nebo účinné metabolity a optimalizovat bezpečnostní a účinnostní profil sloučeniny.
Integrace kvalitativní a kvantitativní analýzy usnadňuje rozhodování v preklinických multispecies studiích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této případové studie bylo demonstrovat plně integrovanou platformu UNIFI a Vion IMS QTof pro identifikaci a kvantifikaci metabolitů nefazodonu v hepatocytech čtyř druhů (potkan, pes, makak a člověk).
Studie ilustruje hlavní kroky workflow: od automatizovaného vyhledávání a mapování metabolitů přes lokalizaci biotransformace až po trend plotting a hloubkovou charakterizaci neznámých látek.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky nefazodonu (10 µM) inkubované s cryoprezervovanými hepatocyty potkana, psa, makaka a člověka (0, 5, 15, 30, 45 min) byly ukončeny acetonitrilem a centrifugovány.
LC separace:

• Acquity UPLC I-Class s FTN autosampler
• Column: Acquity UPLC HSS T3 2.1×100 mm, 1.8 µm, teplota 45 °C, proud 0,6 mL/min
• Mobile phase A: voda+0,1 % kys. mravenčí; B: acetonitril+0,1 % kys. mravenčí; gradient 0–4 min: 98→40 % A

MS detekce:

• Vion IMS QTof, ionizace ESI+; režim HDMSᴱ, 0,1 Hz
• Teploty zdroje 120 °C, odsolování 450 °C, průměr 800 L/h
• Referenční m/z 556,2765 (leucin enkephalin)

Softwarová platforma UNIFI pro správu dat, workflow a knihovny struktur.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo zavedeno osm klíčových kroků workflow:

• Metabolite review: automatické vyhledání a vizualizace m/z odpovídajících predikovaným metabolitům
• Metabolite map: grafické znázornění strukturních modifikací
• Biotransformation localization: přesné určení pozice modifikace pomocí fragmentační dat
• Trendplot: sledování kinetiky tvorby metabolitů napříč vzorky
• Summarize across samples: porovnání odpovědí všech metabolitů ve všech vzorcích
• Standard curve: kontrola kvantitativní lineárnosti
• Drug related properties: vyhledávání podle fragmentů, ztrát nebo izotopických vzorců
• Metabolite review annotated: filtrování a označení metabolitů k reportu

Při srovnání druhů byl identifikován jak společný metabolit (+O) ve všech druzích, tak makak-/lidsky-specifické (+2O) a potkan-specifické (hydroxylace+glukuronidace).
Logaritmické farmakokinetické profily (0–45 min) ukázaly časový průběh poklesu rodičovské látky a vzestupu hlavních metabolitů.
Elucidační nástroje umožnily vyhledat neznámé drogy podle diagnostických fragmentů (např. m/z 290,149) a odhalit navazující oxidativní a glukuronidativní cesty.
Ion mobility/CCS data bylo automaticky kalkulováno pro přesnější rozlišení izobarických signálů.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný přístup UNIFI+Vion:

• zrychluje a standardizuje prohlížení rozsáhlých datasetů multispecies studií
• umožňuje simultánní kvalitativní a kvantitativní analýzu
• poskytuje robustní CCS hodnoty pro lepší identifikaci
• podporuje sdílení workflow a reportů v síti
• zaručuje GLP/GMP shodu a auditní stopu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření použití IMS/CCS dat pro komplexní biotransformační studie, včetně bioterapeutik.
Pokročilé databázové propojení a strojové učení umožní automatizaci predikce nových metabolických cest.
Integrace s cloudovými a AI platformami zrychlí spracování velkých datových objemů.

Závěr

Platforma UNIFI spojená s Vion IMS QTof nabízí ucelené a budoucnost-orientované řešení pro identifikaci a kvantifikaci metabolitů napříč více druhy.
Flexibilita workflow a integrace kvalitativních, kvantitativních a ion mobility dat výrazně zvyšuje efektivitu a spolehlivost DMPK studií.

Reference

1. Biopharmaceutical Platform Solution with UNIFI – Key Applications. Waters Application Notebook 720004887EN (2017).
2. Wrona M., Kirk J., Alelyunas Y. Quantitation of High Resolution MS Data Using UNIFI: Acquiring and Processing Full Scan or Tof-MRM Datasets for Quantitative Assays. Waters Application Note 720005605EN (2016).
3. Kirk J., Mortishire-Smith R., Wrona M. Integrating Ion Mobility into Routine Metabolite Identification Studies using the Vion IMS QTof Mass Spectrometer. Waters Application Note 720006121EN (2017).
4. Blech S., Laux R. Resolving the microcosmos of complex samples: UPLC/travelling wave ion mobility separation high resolution mass spectrometry for the analysis of in vivo drug metabolism studies. Int. J. Ion Mobil. Spec. 16:5 (2013).