LC-MS/MS Analysis of Urinary Benzodiazepines and Z-drugs via a Simplified, Mixed-Mode Sample Preparation Strategy

Význam tématu

Benzodiazepiny a Z-drugs jsou klíčové psychoaktivní látky užívané v medicíně i zneužívané rekreačně a jejich spolehlivé stanovení v moči je zásadní pro forenzní toxikologii, monitorování dodržování léčby a prevenci předávkování. Epidemiologická data ukazují rapidní nárůst počtu úmrtí spojených s benzodiazepiny, což vyzdvihuje potřebu rychlých, citlivých a robustních analytických metod s minimem pracovní náročnosti.

Cíle a přehled studie

Metoda byla vyvinuta s cílem zjednodušit přípravu vzorku moče pro LC-MS/MS analýzu komplexního panelu 21 benzodiazepinů, jejich metabolitů a Z-drugů. Využívá hybridní sorbent Oasis MCX µElution Plates pro rychlou extrakci v jedné destičce a systémy Waters ACQUITY UPLC a Xevo TQ-S micro pro separaci a detekci.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek moče 200 µL, interní standardy, 200 µL pufru NH4OAc pH 5 s β-glukuronidázou
• Enzymatická hydrolýza v mikrodestičce při 50 °C po dobu 1 hodiny
• Neutralizace 200 µL 4 % H3PO4, přímé nabytí sorbentu bez kondicionace a equilibrace
• Omytí sorbentu 0,02 N HCl a 20 % methanolu, vysušení vysokým vakuu
• Eluce 2×25 µL acetonitril–methanol s 5% NH4OH, následné ředění
• Chromatografie na CORTECS UPLC C18+ 1,6 µm (2,1×100 mm), gradient 90:10–95:5 formiát voda–formiát ACN, průtok 0,5 mL/min
• MS detekce ESI+ v módu MRM na Xevo TQ-S micro
• Možnost škálování na kolónu CORTECS C18+ 2,7 µm (3,0×100 mm) při <4000 psi
• Software MassLynx s TargetLynx pro kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozlišení všech 21 analytů v časech 1,07–5,14 min (UPLC) a 1,98–6,69 min (HPLC); klíčové páry baseline separovány
• Průměrné zotavení 76–102,5 % (průměr 91 %) s CV 5,2–15 % (průměr 8,6 %)
• Matricové efekty sníženy na 17,7 % oproti 25,3 % u reverzní fáze
• Kalibrační rozsah 0,5–500 ng/mL, LOQ 0,5 ng/mL, ULOQ 500 ng/mL
• Lineární a kvadratické křivky s váhou 1/x, R2 > 0,997
• Intra- a inter-batch přesnost a opakovatelnost ≥ 90 %, CV ≤ 10 % ve všech QC úrovních

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení a zjednodušení přípravy vzorku bez ztráty kvality
• Snížení spotřeby organických rozpouštědel a odpadu
• Minimální počet přenosů vzorku snižující riziko kontaminace
• Vhodné pro vysokopropustné forenzní laboratoře
• Kompatibilní s běžným HPLC i moderním UPLC vybavením

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a online SPE integrace pro další zvýšení průchodnosti
• Rozšíření na další skupiny léčiv a jejich metabolitů v klinické diagnostice
• Multiplexní analýzy pro komplexní toxikologické screeningy
• Implementace v environmentálních a farmakovigilančních studiích

Závěr

Navržená metoda nabízí rychlou, robustní a vysoce výkonnou analýzu benzodiazepinů a Z-drugů v moči s vynikajícími analytickými parametry. Minimalizuje pracovní náročnost, zkracuje dobu přípravy a zvyšuje průchodnost forenzních laboratoří.

Reference

• Jufer-Phipps R Levine B Benzodiazepines In Principles of Forensic Toxicology AACC Press Washington DC 2013 237–270
• Karithanom M Number of Deaths from Prescription Drugs National Institute of Drug Abuse National Overdose Deaths CDC Wonder 2015
• Laloup M Fernandez MdMR De Boeck G Wood M Maes V Samyn N Validation of a Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Simultaneous Determination of 26 Benzodiazepines and Metabolites Zolpidem and Zopiclone in Blood Urine and Hair Journal of Analytical Toxicology 2005 29(7) 616–626
• Marin SJ Coles R Merrell M McMillin GA Quantitation of Benzodiazepines in Urine Serum Plasma and Meconium by LC MS MS Journal of Analytical Toxicology 2008 32(7) 491–498
• Marin SJ Roberts M Wood M McMillin GA Sensitive UPLC–MS MS Assay for 21 Benzodiazepine Drugs and Metabolites Zolpidem and Zopiclone in Serum or Plasma Journal of Analytical Toxicology 2012 36(7) 472–476