Offline and online sample extraction for the quantification of benzodiazepines in human plasma or serum for clinical research

Význam tématu

Ben­zo­dia­ze­pi­ny jsou široce používané psychoaktivní látky při léčbě úzkostí, nespavosti a svalových křečí. Pro klinický výzkum, terapeutické monitorování a farmako­kinetické studie je nezbytné přesné stanovení jejich koncentrací v lidské plas­mě či séru. Optimalizované analytické metody zajišťují spolehlivost výsledků a umožňují zpracování většího počtu vzorků za krátký čas.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a validovat citlivou, robustní a flexibilní LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci 34 různých ben­zo­dia­ze­pinů v lidské plas­mě nebo séru. Metodu bylo možné provozovat ve dvou variantách přípravy vzorku: plně automatizované přímé vstřikování nebo offline proteinová precipitace pro vyšší citlivost.

Použitá metodika

Pro stanovení analy­tů byly připraveny čtyři kalibrátory pokrývající cílové koncentrační rozsahy uvedené v tabulce 1 a dva kontrolní vzorky. Jako interní standardy sloužilo 20 deuterovaných sloučenin. Přistoupilo se k těmto variantám:

• Přímé vstřikování: automatické doplnění interních standardů přímo v autosampleru a online SPE před chromatografickou separací bez předchozí extrakce.
• Offline precipitace: 50 µl plasmy/sera bylo sráženo 100 µl precipitantu s interními standardy, vzorky se vířily, odstředily a supernatant se přenesl k analýze.

Chromatografická separace probíhala na kolonách a SPE cartridgích výrobce RECIPE při běžných mobilních fázích. Délka analýzy činila 8,5 min pro přímé vstřikování a 7,5 min pro offline precipitaci. Detekce ve fázi MS byla realizována metodou vybraných SRM přechodů v pozitivním režimu se zahřátou elektrosprejovou ionizací.

Použitá instrumentace

• LC systém Thermo Scientific Transcend II TLX-1
• Triplární kvadrupólový hmotnostní spektrometr Thermo Scientific TSQ Endura
• On-line TDM platforma RECIPE MS9050 s přídavným modulem MS9550 (pro přímé vstřikování)
• Off-line TDM platforma RECIPE MS9000 s modulem MS9500 (pro precipitaci)
• Software Thermo Scientific TraceFinder 3.3 pro akvizici a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala v obou přístupech lineární odezvu v rozsahu kalibrátorů i při až 20násobném ředění nejnižšího kalibrátoru. Mezi­normální koncentrační bias se pohyboval pro přímé vstřikování mezi –3,1 % a 15,6 %, pro offline precipitaci mezi –7,3 % a 12,4 %. Intra-assay precize (%CV) byla pod 14 % pro všechny analy­ty kromě zopiklony, u které se projevila nižší stabilita. Inter-assay precize nepřekročila 12,6 % (opět s výjimkou zopiklony). Výsledky potvrzují vysokou přesnost, reprodukovatelnost a citlivost obou přístupů.

Přínosy a praktické využití metody

Flexibilita přípravy vzorku umožňuje laboratořím přizpůsobit workflow (minimální intervence vs. maximální citlivost). Jediná analy­tická metoda pokryje 34 běžných ben­zo­dia­ze­pinů v jedné šarži, což zefektivňuje čas, snižuje spotřebu rozpouštědel a materiálové náklady. Metoda je vhodná pro farmakokinetické studie, terapeutické monitorování a klinický výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření multiplexních metod na širší spektrum farmak a jejich metabolitů, dále miniaturizace a další automatizace přípravy vzorků. Integrace umělé inteligence pro zpracování dat a prediktivní modelování může zvýšit efektivitu a spolehlivost analýz. Point-of-care řešení založená na rychlých MS platformách by mohla přiblížit měření k pacientovi.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metodika umožňuje citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci 34 ben­zo­dia­ze­pinů v lidské plas­mě či séru. Dva přístupy přípravy vzorku poskytují laboratořím nutnou flexibilitu a splňují požadavky na citlivost, linearitu, přesnost i precizi nezbytné pro klinický výzkum a terapeutické monitorování.