Small Scale Purification of Fractions from a Complex Pharmaceutical Formulation Using the Waters Fraction Manager-Analytical and an ACQUITY Arc System

Význam tématu

Purifikace drobných objemů jednotlivých frakcí z komplexních farmaceutických vzorků je zásadní pro izolaci, identifikaci a kvantifikaci účinných či pomocných složek. Přesné řízení sběru frakcí při nízkých průtocích zajišťuje vysokou čistotu a reprodukovatelnost, což je klíčové ve vývoji nových léčiv i v kontrole kvality hotových farmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat malorozměrovou purifikaci jednotlivých složek modelové komplexní farmaceutické formulace (DayQuil) pomocí systemu Waters Fraction Manager – Analytical (WFM-A) ve spolupráci s ACQUITY Arc UHPLC. Studie sledovala dva přístupy frakcionace: masově řízenou (mass-directed) a časově řízenou (time-based), a porovnala jejich účinnost při izolaci analytů s různým spektrem detekce.

Použitá metodika

Vzorek DayQuil byl připraven ředěním v acetonitrilu, injekční objem 10 µl vedl k nastaveným koncentracím acetaminofenu, dextromethorfanu a fenylefrinu. Separace probíhala na sloupci SunFire C18 (4,6 × 100 mm, 3,5 µm) při 40 °C s gradientem vodné fáze A (0,1 % kyseliny mravenčí) a acetonitrilu B (0,1 % kyseliny mravenčí).
Masově řízená frakcionace využívala detektor ACQUITY QDa pro spouštění sběru v okamžiku průchodu definované hmotnosti (m/z). Časově řízená frakcionace oddělila hrubý vzorek na tři frakce, které byly následně znovu analyzovány s optimalizovanými krátkými gradienty.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Arc UHPLC System
• Waters Fraction Manager – Analytical (WFM-A)
• ACQUITY QDa Mass Detector (ESI+)
• ACQUITY UPLC Photodiode Array Detector
• SunFire C18 kolona, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm
• MassLynx v4.2 s aplikací FractionLynx

Hlavní výsledky a diskuse

Masově řízená frakcionace umožnila selektivně shromažďovat ionty m/z 261 a m/z 272 ve špičkách o objemu pod mikrolitru. Čistota frakcí byla potvrzena hmotnostními spektry; v případě nedokonalého rozlišení se projevila kontaminace souběžně elujících analytů (m/z 217, 305), doporučeno využití logické operace NOT pro vyšší čistotu.
Časově řízená frakcionace rozdělila vzorek na tři části, jejichž opětovná analýza s upravenými gradienty zlepšila separaci drobných složek. Ve frakci 3 se projevila interference polyethylenglykolu (PEG) charakterizovaná opakovanými signály odstupňovanými o 44 Da.
Duální detekce QDa + PDA výrazně rozšířila sledovaný rozsah látek: některé komponenty bez chromoforů byly detekovatelné pouze hmotnostním detektorem.

Přínosy a praktické využití metody

• Schopnost izolovat malé objemy úzkých analytických špiček při sub-µl průtocích.
• Mass-directed sběr umožňuje cílenou purifikaci i analytů bez UV absorbance.
• Flexibilní workflow spojující offline multidimenzionální přístup s rychlou reanalýzou.
• Aplikace v úpravě a optimalizaci separačních metod pro QA/QC i výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace WFM-A do online multidimenzionálních LC-MS(n) systémů.
• Využití alternativních chromatografických režimů (SFC, GC) pro zvýšení rozlišení.
• Pokročilé algoritmické řízení frakcionace v reálném čase, včetně strojového učení.
• Další miniaturizace a automatizace pro vysokokapacitní screening.

Závěr

Osvědčené kombinace ACQUITY Arc UHPLC a Waters Fraction Manager – Analytical poskytují spolehlivou platformu pro malorozměrovou purifikaci a izolaci složek z komplexních farmaceutických formulací. Dual-detekce a volitelné režimy frakcionace přinášejí vysokou flexibilitu a přesnost ve farmaceutické analýze.

Reference

• Dwight SR., Maloney TD. Recent Advances in Two-Dimensional Liquid Chromatography for Pharmaceutical and Biopharmaceutical Analysis. LCGC North America 2017;35(9):680–687.
• Aubin A., Jablonski J. Small Scale Peptide and Impurity Isolation Using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager – Analytical Systems. 720005500EN. 2015.