Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides

Význam tématu

Metody kapalné chromatografie s UV detekcí a hmotnostní spektrometrií patří mezi klíčové nástroje pro analýzu syntetických oligonukleotidů v biomedicínském výzkumu, farmaceutickém vývoji a rutinní kontrole kvality. Iontové párování umožňuje selektivní retenci silně polárních a aniontově nabitých sloučenin a významně ovlivňuje jak chromatografické vlastnosti, tak citlivost a kvalitu MS dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo porovnat dopad různých iontově párovacích systémů (triethylammonium, butylammonium, dibutylammonium, hexylammonium s octovou kyselinou nebo HFIP) na retenci, rozlišení a MS odezvu oligonukleotidů různých typů (DNA ladder, RNA standardy, terapeutické ONs). Analýzy proběhly na Agilent 1290 Infinity II LC s UV-DAD a Agilent 6530 LC/Q-TOF.

Použitá metodika a instrumentace

Ion-pairing reversed-phase LC na kolóně AdvanceBio Oligonucleotide (2.1×50 mm, 2.7 μm).
Mobilní fáze: equimolární roztoky aminů s octanem (100 mM TEAA, HAA, DBAA) nebo kombinace aminu (15 mM) s HFIP (25–400 mM) v H2O, organické modifikátory MeOH nebo ACN, gradienty nastavené podle typu analýzy.

• DAD: detekce při 260 nm, referenční 355 nm, šířka vrcholu >0.025 min.
• MS: ESI negativní režim, Agilent Jet Stream, m/z 400–3200, scan 3 spektra/s, režim Extended Dynamic Range (2 GHz).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC System (High-Speed Pump, Multisampler s termostatem, DAD, Multicolumn Thermostat)
• Agilent 6530 LC/Q-TOF s technologií Jet Stream ESI
• Software Agilent OpenLab CDS ChemStation, Agilent MassHunter (Acquisition, Qualitative Analysis)

Hlavní výsledky a diskuse

• Amin-octanové systémy na bázi HAA a DBAA poskytují lepší retenci a vyšší rozlišení než standardní TEAA pro DNA i RNA standardy.
• Mobilní fáze TEA/HFIP zvyšují citlivost ESI MS, ale vysoká koncentrace HFIP podstatně zvyšuje náklady.
• Snížení HFIP na 25 mM při použití HA nebo DBA zachová či dále zlepšuje separaci a nabídne čistší MS spektra (vyšší nabité stavy, méně aduktů).
• Testy na terapeutických ON prokázaly výrazné zvýšení rozlišení krátkých nečistot (shortmers) a nižší tvorbu aduktů.

Přínosy a praktické využití metody

• Optimalizace složení mobilní fáze podle konkrétního ON typu snižuje spotřebu drahých reagentů a zkracuje dobu analýzy.
• Zlepšená MS citlivost a nižší počet aduktů usnadňují přesnou identifikaci a kvantifikaci hlavního produktu i nečistot.
• Metodu lze snadno implementovat v rutinních QA/QC i R&D laboratořích pro kontrolu kvality a vývoj biopharma produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových iontových párovacích činidel s lepší rozpustností a nižší toxicitou.
• Nasazení multidimenzionálních LC (2D-LC, MMC) pro komplexní separaci modifikovaných ON.
• Automatizace optimalizace metod pomocí chemometrie a strojového učení.
• Propojení s HRMS a ion mobility pro detailní charakterizaci sekvenčních modifikací.

Závěr

Přesné ladění iontově párovací složky a koncentrace HFIP má zásadní vliv na chromatografický výkon i kvalitu MS dat u oligonukleotidů. Alternativní aminy (HA, DBA) při nižších koncentracích HFIP nabízejí srovnatelnou či lepší separaci a MS citlivost s výrazně nižšími náklady. Metoda představuje univerzální a efektivní platformu pro analýzy ON v biopharma aplikacích.

Reference

1. Goyon A.; Yehl P.; Zhang K. Characterization of Therapeutic Oligonucleotides by Liquid Chromatography. J. Pharm. Biomed. Anal. 2020, 182, 113105.
2. Vanhinsbergh C. J. Analytical Separation Methods for Therapeutic Oligonucleotides. LC-GC Chromatography Online 2020, 33(10), 20–26.
3. Li Q. et al. Comprehensive Hydrophilic Interaction and Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography for Analysis of Di- to Deca-Oligonucleotides. J. Chromatogr. A 2012, 1255, 237–243.
4. Krieger S.; Dickhut C. Direct Analysis of In-Process Oligonucleotides Without Manual Purification. Agilent Technologies Application Note 5991-9490EN, 2018.
5. Apffel A. et al. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 1997, 69, 1320–1325.
6. Apffel A. et al. New Procedure for the Use of HPLC-ESI MS for the Analysis of Nucleotides and Oligonucleotides. J. Chromatogr. A 1997, 777, 3–21.
7. Gilar M. et al. Ion-Pair Reversed-Phase HPLC Analysis of Oligonucleotides: Retention Prediction. J. Chromatogr. A 2002, 958(1–2), 167–182.
8. McGinnis A. C.; Grubb E. C.; Bartlett M. G. Systematic Optimization of Ion-Pairing Agents and HFIP for Enhanced ESI MS of Oligonucleotides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2013, 27(23), 2655–2664.
9. Gong L.; McCullagh J. S. O. Comparing Ion-Pairing Reagents and Sample Dissolution Solvents for IPLC/ESI MS of Oligonucleotides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28(4), 339–350.