ANALÝZA ALKALOIDŮ V MAKOVINĚ METODOU VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE

Význam tématu

Analýza alkaloidů v makovině je klíčová pro kontrolu kvality, legislativní dodržování limitů a selektivní šlechtění odrůd máku setého s definovaným obsahem morfinu. Poppy straw představuje hlavní surovinu pro výrobu farmaceutických přípravků a současně podléhá přísným požadavkům na obsah omamných látek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout, optimalizovat a validovat rychlou a spolehlivou metodu pro extrakci a kvantifikaci pěti hlavních opiových alkaloidů (morfin, kodein, thebain, papaverin, noskapin) v makovině metodou HPLC s UV/VIS detekcí. Vyvinutá metodika byla aplikována na reálné vzorky makoviny z šlechtitelských pokusů.

Použitá instrumentace

• Vysokoúčinný kapalinový chromatograf Agilent 1200 se sekvenčním čerpadlem, vakuovým odplyňovačem a UV/VIS detektorem
• Kolona Ascentis Express F5 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm)
• Automatický dávkovač vzorků s termostatovaným nástřikovým blokem
• Ultrazvuková lázeň TESON 10, třepačka TE III
• Centrifugační stolice K 2015 (3900 ot/min)
• Vakuový SPE manifold Mediwax-12 a SPE kolony Chromabond HR-XC (200 mg/3 ml)
• Rotární vakuová odparka RV 8

Použitá metodika

Vzorky makoviny byly sušeny, mleté a extrahovány 5% octovou kyselinou v ultrazvuku (30 min) s následnou separací alkaloidů na SPE kolonkách HR-XC. Eluce byla provedena 5% amoniakem v methanolu, eluáty koncentrovány rotační odparkou, doplněny methanolem a analyzovány HPLC ve 30minutovém gradientu (mobilní fáze A: 5% acetonitril, B: acetonitril : led. octová kyselina : triethylamin = 97,9 : 2 : 0,1). Detekce při 284 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla lineárního rozsahu pro morfin 4–500 μg/ml (R2 = 0,9998), LOD = 1,28 μg/ml, LOQ = 4,22 μg/ml, opakovatelnost 4,6 % a výtěžnost 96–98 %. Robustnost vůči změnám extrakční doby, složení extrakčního činidla, teplotě kolony a počátečnímu bodu gradientu byla potvrzena. Aplikace na 10 reálných vzorků odhalila obsah morfinu 0,04–1,47 % hm. a přítomnost kodeinu, thebainu, papaverinu či noskapinu.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení klíčových alkaloidů v makovině pro potřeby šlechtění, registrace odrůd, kontroly jakosti a legislativního dohledu nad obsahem omamných látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace hmotnostní detekce (HPLC-MS) pro zvýšení citlivosti a specificity
• Automatizace přípravy vzorků a miniaturizace SPE kroků
• Rozšíření metody o chirální separace pro enantiomerické studie alkaloidů
• Nasazení v terénních laboratořích a na rychlé skríningové stanovení

Závěr

Byla úspěšně vyvinuta a validována metoda HPLC-UV/VIS s efektivní extrakcí a SPE čištěním pro kvantifikaci pěti opiových alkaloidů v makovině. Metoda je robustní, citlivá a vhodná pro rutinní aplikace v analýze kvality a obsahu alkaloidů v máku setém.

Reference

1. Schulzová V., Hajšlová J. Toxické alkaloidy v potravinovém řetězci člověka. Vědecký výbor fytosanitární a životního prostředí. 2007.
2. Singh D.V. et al. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 23, 1757 (2000).
3. Vašák J. Mák. Powerprint, Praha 2010.
4. Baranyk P. et al. Olejniny. Profi Press, Praha 2010.
5. Moravcová J. Biologicky aktivní přírodní látky. VŠCHT Praha 2006.
6. Zenk M.H., Juenger M. Phytochemistry 68, 2757 (2007).
7. Prugar J. Kvalita rostlinných produktů na prahu 3. tisíciletí. VÚPS, Praha 2008.
8. Kabátová N., Šulová R. Bul. Národní ref. lab. XVII/1 (2013).
9. Bechyně M. et al. Mák. Semafor, Praha 2001.
10. Cihlář P. et al. Konf. Řepka a Mák, ČZU Praha 2004.
11. Zukalová H. et al. Konf. Prosperující olejniny, ČZU Praha 2006.
12. Zehnálek P. Úroda 5, 51 (2014).
13. Lachman J. et al. Plant Soil Environ. 52, 282 (2006).
14. Zukalová H. et al. Konf. Prosperující olejniny, ČZU Praha 2007.
15. Zehnálek P. Seznam doporučených odrůd, ÚKZÚZ Brno 2014.
16. Stöckigt J. et al. J. Chromatogr. A 967, 85 (2002).
17. Terenerry V.C. et al. J. Chromatogr. A 718, 217 (1997).
18. Schulz H. et al. Analyst 129, 917 (2004).
19. Pothier J., Galand N. J. Chromatogr. A 1080, 186 (2005).
20. Popa D.S. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 18, 645 (1998).
21. Jelínek I. et al. Chem. Listy 91, 487 (1997).
22. Verma R.K. et al. Indian J. Pharm. Sci. 52, 276 (1990).
23. Krenn L. et al. Chromatographia 47, 21 (1998).
24. Pettitt B.C., Damon C.E. J. Chromatogr. A 242, 189 (1982).
25. Seidi S. et al. Anal. Chim. Acta 701, 181 (2011).
26. Gómez-Serranillos P. et al. Fitoterapia 2, 156 (1995).
27. Yoshimatsu K. et al. Chem. Pharm. Bull. 53, 1446 (2005).
28. Meng Q.Ch. et al. J. Chromatogr. B 742, 115 (2000).