An MSn platform for detailed characterisation of both the peptide and the glycan moieties and the peptide/glycan linkage in glycoproteins

Význam tématu

Glykoproteiny představují klíčovou třídu biologických makromolekul s kritickou úlohou v imunologii, buněčné signalizaci a léčebných proteinech. Vzhledem k přísným požadavkům regulací na biosimilární produkty je nezbytné detailní určení peptidové sekvence, glykanové struktury a vazebných míst. Pokročilá platforma založená na MSn analýze a speciálním softwaru umožňuje splnit tyto nároky v praxi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout postup kombinující vícestupňovou MALDI-MS analýzu a softwarové nástroje, které umožní komplexní charakterizaci glykopeptidů i volných glykanů. Modelovým analytem byl lidský apo-transferrin, z něhož byly izolovány glykopeptidy GP1 a GP2 a následně sledovány jejich sekvence, glykanová složení a izomerie.

Použitá metodika a instrumentace

• Proteinová úprava: redukce, alkylace a tryptická digestace transferrinu s obohacením glykopeptidů
• MALDI-QIT-TOF hmotnostní spektrometr (Axima Resonance, Shimadzu UK) pro MS2 a MS3 analýzy
• Software SIMSE (Shimadzu) pro de novo sekvenování peptidu a určení glykanové kompozice na základě charakteristického tripletu fragmentů
• Enzymatické uvolnění N-glykanů pomocí PNGase F, čištění na C18 a grafitových matricích a značení aminopyridinem
• Accurate Glycan Analyser (AGA, Shimadzu Corp) pro řízenou MSn analýzu glykanů až do úrovně MS4 a porovnání s databází referenčních spekter

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza GP1 (m/z 3099) identifikovala peptidovou sekvenci CGLVPVLAENYNK s glykanem v poloze Asn432, a GP2 (m/z 4137) sekvenci QQQHLFGSNVTDCSGNFCLFR s glykanem v poloze Asn630. Hmotnostní rozdíl mezi glykopeptidem a peptidovou částí odpovídal glykanové kompozici Hex5HexNAc4. AGA potvrdila biantennární strukturu tohoto glykanu v desialylované i natívní formě a identifikovala přítomnost jedné až dvou sialových kyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a precizní charakterizace peptide/glykan vazebných míst
• Rozlišení izomerních variant glykanů díky řízené vícestupňové analýze
• Podpora vývoje a kontroly kvality biosimilárních léčiv
• Možnost aplikace v proteomice a glykomice výzkumu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s ultra vysokým rozlišením, automatizované workflow pro vyšší propustnost a rozšíření databází glykanových spekter. Kombinace s bioinformatickými nástroji a umělou inteligencí umožní rychlejší interpretaci složitých vzorků a nasazení v klinické diagnostice.

Závěr

Kombinace platformy MALDI-QIT-TOF hmotnostní spektrometrie a softwarových balíků SIMSE a AGA představuje výkonný nástroj pro komplexní charakterizaci glykoproteinů. Tento přístup pokrývá peptidovou sekvenci, glykanovou kompozici, vazebné místo i přesnou izomerii glycanu.

Reference

• Montgomery HV, Openshaw ME, Belgacem O, Murase M, Tanaka K. An MSn platform for detailed characterisation of both the peptide and the glycan moieties and the peptide/glycan linkage in glycoproteins. IMSC 2012.
• Shimadzu Corporation. Accurate Glycan Analyser Software Manual.