MSn Analyses for Tryptophan-Conjugated ADC Mimic by Miniature MALDI Digital Ion Trap Mass Spectrometer (MALDI-DIT-MS)

Význam tématu

Antibody drug conjugates (ADC) spojují vysokou selektivitu monoklonálních protilátek s účinností nízkomolekulárních léčiv, čímž nabízejí cílenější a efektivnější onkologickou terapii. Precizní charakterizace míst a rozsahu konjugace malých molekul na aminokyselinné zbytky v protilátce je zásadní pro zajištění stability, biologické aktivity a bezpečnosti ADC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce bylo vytvořit pseudo-ADC model, ve kterém je na zbytky tryptofanu standardní lidské monoklonální protilátky (NISTmAb) navázán fluoresceinový derivát Me-fluorescein-ABNO, a následně identifikovat přesné pozice těchto modifikací pomocí malé digitální jímací pasti MALDImini™-1.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval:

• Chemickou konjugaci Me-fluorescein-ABNO na tryptofanové zbytky podle protokolu Seki et al. (J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 10798–10801).
• Redukci a alkylační úpravu protilátky následovanou tryptickou štěpnou inkubací.
• Desalting peptidů pomocí Ziptip μC18 a nanostříknutí na MALDI desku.
• Nanášení matrice DHB (2,5-dihydroxybenzoová kyselina) a měření na MALDImini™-1 s plně digitální jímací pastí.
• Provádění MS, MS/MS a MS3 analýz vybraných iontů.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve spektru modifikované protilátky se objevily unikátní ionty m/z 2416,9, 2430,7, 2452,7 a 2560,9, které chyběly u nenavázané protilátky. Podrobná MSn rozbor ukázal, že:

• Iont m/z 2416,9 po eliminaci modifikační skupiny dal fragment m/z 1677,7, odpovídající peptidovému řetězci 278FNWYVDGVEVHNAK291.
• Iont m/z 2560,9 po eliminaci modifikační skupiny vedl na fragment m/z 1808,0, přiřaditelný sekvenci 305VVSVLTVLHQDWLNGK320.

Obě sekvence obsahují zbytkový tryptofan, což potvrzuje selektivní navázání fluoresceinového derivátu právě na tyto pozice.

Přínosy a praktické využití metody

MALDI-DIT MS s funkcí víceúrovňové fragmentace (MSn) představuje rychlý a citlivý nástroj pro lokalizaci a kvantifikaci chemických modifikací v komplexních biomolekulách. Metoda přispívá k:

• Rychlé kontrole kvality (QA/QC) ADC přípravků během vývoje a výroby.
• Detailní charakterizaci míst konjugace pro optimalizaci stability a účinnosti ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směřování zahrnuje:

• Rozšíření analýzy na další typy konjugací (např. na lysinové či cysteinové zbytky).
• Integraci s automatizovanými platformami pro vysokopropustné analýzy.
• Zlepšení rozlišovací schopnosti a citlivosti MALDI-DIT systémů.
• Aplikaci in vivo a ex vivo studiích stability a distribuce ADC.

Závěr

Malý digitální jímací pastový hmotnostní spektrometr MALDImini™-1 prokázal schopnost detailní MSn analýzy tryptophanem vázaných fluoresceinových derivátů na modelové ADC. Metoda nabízí perspektivu pro efektivní monitoring a vývoj nových konjugovaných léků.

Reference

[1] Seki Y., et al. Site-Selective Protein Modifications on Tryptophan by an Organoradical Reagent. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 10798–10801.