Analysis of N-Linked Glycan using MALDImini™-1 Compact MALDI Digital Ion Trap Mass Spectrometer: Structural Analysis and Identification of Sialyl Linkage Isomers

Význam tématu

Analýza N-vázaných glykosidických řetězců na proteinech je zásadní pro pochopení biologických procesů a nemocí, neboť koncové sialické kyseliny a jejich vazebné izomery ovlivňují antigenitu, adhezi a virové interakce.
Tradiční HPLC selhává při rychlé identifikaci vazebních izomerů a konvenční MS trpí ztrátou labilních sialických zbytků.
SALSA (Sialic Acid Linkage Specific Alkylamidation) řeší tyto problémy chemickou modifikací, která stabilizuje sialové vazby a umožňuje jejich rozlišení podle hmotnostního posunu.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na krevní sérové N-glykany jako model.
Cílem bylo:

• Uvolnit a chemicky modifikovat sialické zbytky pomocí SALSA.
• Označit redukční konec glykosidů fluorogenním činidlem 2-aminobenzamidem (2AB).
• Prokázat diferenciaci α2,3- a α2,6-sialylace pomocí MALDImini-1 MALDI-DIT MSn.

Použitá metodika a instrumentace

Uvolnění N-glykanů:

• Denaturace séra SDS a redukce DTT, přidání NP-40 a enzymu PNGaseF, inkubace 37 °C/18 h.

Modifikace SALSA:

• Reakce s isopropylaminem (iPA) pro α2,6- a methylaminem (MA) pro α2,3-sialylaci (1 h, pokojová teplota).
• Stabilizace laktonové formy, očištění GL-Tip Amide.

Označení 2AB a příprava na MALDI:

• Redukující konce glykosidů značené 2-aminobenzamidem, odstranění přebytečného činidla.
• Nanesení vzorku a matrice CHCA+NaCl na MALDI kazetu.

Instrumentace:

• MALDImini-1 Compact MALDI-DIT Mass Spectrometer pro MSn analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

MS1 spektrometrie odhalila komplexní bi- a triantennární glykany.
Rozlišení vazeb izomerů bylo dosaženo díky hmotnostnímu rozdílu +28 Da (iPA) vs +41 Da (MA).
MS2 neutrální ztráty modifikovaných sialových zbytků potvrdily vazební typy u m/z 3117,1 (směs α2,3/α2,6) a 3145,2 (čistě α2,6).
MS3 fragmentace umožnila lokalizaci fragmentů na specifické větve a analýzu jádra glykosidu.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá a spolehlivá diferenciace vazebních izomerů sialových zbytků.
Zvýšení stability labilních glykanů během analýzy.
Možnost aplikace v biomarkerovém výzkumu, QC farmaceutických glykoproteinů a studiích virových glykoproteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření SALSA techniky na glykolipidy a jiné typy glykokonjugátů.
Integrace s kapalinovou chromatografií pro vysokokapacitní analýzu.
Automatizace derivatizačních kroků a rozvoj klinických aplikací.

Závěr

Kombinace SALSA chemické modifikace a MSn analýzy na MALDImini-1 představuje účinné řešení pro strukturální analýzu glykosidů včetně vazeb sialových kyselin, přináší vyšší citlivost, stabilitu a selektivitu.

Reference

• Nishikaze T, et al. Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling. Anal Chem 2017;89:2353–2360.
• Hanamatsu H, et al. Sialic Acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones. Anal Chem 2018;90(22):13193–13199.