Liquid-Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry for 28 Bile Acids Profiling in Serum Samples

Význam tématu

Profilace žlučových kyselin poskytuje hluboký pohled na metabolické a mikrobiální interakce v organismu. Detailní stanovení jednotlivých konjugovaných a nekonjugovaných žlučových kyselin pomáhá odhalit změny v lipidovém metabolismu, hodnocení funkce jater a vliv střevní mikrobioty na zdravotní stav.

Cíle a přehled studie

Studie představuje nově vyvinutý analytický balíček pro současnou kvantifikaci 28 žlučových kyselin v biologických vzorcích. Cílem bylo:

• optimalizovat chromatografickou separaci a detekci pomocí LC–MS/MS,
• ověřit metodiku na lidské plasmě a laboratorních vzorcích myšího jaterního homogenátu,
• zajistit vysokou přesnost, reprodukovatelnost a vhodnost pro klinický výzkum a studií střevní mikrobioty.

Použitá metodika a instrumentace

Reagencie a příprava vzorků:

• Standardy cílových žlučových kyselin a deuterované interní standardy (Sigma-Aldrich, Steraloids), příprava zásobních roztoků 100 µM v methanolu.
• Plazma: 50 µl vzorku smícháno s 10 µl interního standardu, přidání HCl a acetonitrilu, centrifugace a vysušení pod vakuem, rekonstituce v 100 µl methanolu.

Chromatografické podmínky:

• Systém: Shimadzu Nexera X2 UHPLC, kolona GL Sciences Inertsil ODS-4 HP 3 µm (150×2 mm), 40 °C.
• Mobilní fáze A: voda + 0,05 % kyseliny octové; B: acetonitril/methanol (40/60).
• Gradient: 35 % B → 50 % B (0,5–0,6 min), do 85 % B (8,4 min), do 100 % B (2 min), návrat, průtok 300 µl/min, injekce 2 µl.

Hmotnostní spektrometrie:

• Triple-quad LCMS-8060 s ESI v negativním režimu (−3 kV), Interface 300 °C, DL 250 °C, Heater Block 400 °C.
• Nebulizační plyn 2 l/min, ohřev a sušení 10 l/min, MRM režim, dobu měření MRM 7 ms, pauza 1 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou selektivitu i při náročné fragmentaci izomerů. Kalibrace byla prováděna jednorázově (1 µM), přesnost poměrových signálů < 10 % RSD. Ve vzorcích lidské plazmy bylo detekováno 16–18 ze 28 analyzovaných žlučových kyselin s průměrnými koncentracemi od jednotek do stovek pmol/ml. Reprodukovatelnost trojí přípravy a dvojí analýzy vzorků vykázala RSD 0,8–38 % v závislosti na sloučenině.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí kompletní panel žlučových kyselin vhodný pro:

• klinickou biochemii a diagnostiku jaterních onemocnění,
• studium vlivu střevní mikrobioty na metabolismus hostitele,
• farmakokinetické a toxikologické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu o konjugované a sekundární metabolity, integrace se sekvenováním mikrobiomu, využití v personalizované medicíně a automatizovaných platformách pro vysokoproduktivní screening.

Závěr

Vyvinutý LC–MS/MS balíček pro kvantifikaci 28 žlučových kyselin poskytuje robustní, citlivé a reprodukovatelné řešení pro výzkum a klinické aplikace. Metoda přináší nový standard pro komplexní profilaci žlučových kyselin v biologických vzorcích.

Reference

Žádné explicitně uvedené literární citace v původním textu.