ROUTINE METABOLITE IDENTIFICATION FOR COMPLEX PEPTIDES BASED ON IMS ENABLED QTOF DIA DATA ACQUISITION AND MASS-METASITE DATA PROCESSING

Význam tématu

V oblasti vývoje peptidových léčiv je klíčové rychle a spolehlivě charakterizovat metabolické dráhy a produkty jejich katabolismu. Začlenění nestandardních aminokyselin, cyklizací a konjugací zvyšuje biologickou stabilitu a účinnost peptidů, ale zároveň komplikuje jejich analytickou identifikaci. Informačně bohatá akvizice dat spojená s výkonným softwarovým zpracováním usnadňuje detailní profilaci ADME parametrů a podporuje rozhodování v raných fázích výzkumu.

Cíle a přehled studie

Studie demonstrovala validní workflow pro rutinní identifikaci metabolit komplexních cyklických peptidů. Metoda kombinuje iontově mobilitní QToF ve spojení s dia režimem HDMSE a cíleným zpracováním dat pomocí softwaru Mass-MetaSite a WebMetabase. Testovacím modelem bylo pět FDA-schválených cyklických peptidů (daptomycin, dalbavancin, oritavancin, anidulafungin, lanreotide) inkubovaných v simulovaném střevním prostředí s chymotrypsinem.

Použitá metodika

In vitro inkubace:

• Koncentrace peptidů: 10 µM v simulované střevní tekutině (SIF)
• Enzymatická lyze: 1000 µg/mL chymotrypsinu, odběry po 0, 5, 15, 120 a 300 minutách
• Quench: 2 objemy ledového acetonitrilu s 1 % kyseliny mravenčí

Akvizice LC-MS:

• LC: ACQUITY H-Class UPLC s kolonkou Peptide BEH C18 (300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 100 mm)
• Gradient: 5 – 40–70 % fáze B (acetonitril + 0,1 % FA) za 8 min, průtok 0,4 mL/min, 60 °C
• MS: Vion IMS QTof v HDMSE režimu s inteligentním přístupem k datům (IDC)

Použitá instrumentace

• ACQUITY H-Class UPLC (Waters)
• UPLC Peptide BEH C18 kolona (300 Å, 1,7 µm)
• Vion IMS QTof (iontová mobilita + QToF technologii)
• Softwarové nástroje: UNIFI platforma, Mass-MetaSite (Molecular Discovery), WebMetabase (Waters)

Hlavní výsledky a diskuse

• Iontově mobilitní filtrace významně zlepšila poměr signál/šum a umožnila čisté extrahované iontové chromatogramy (XIC) pro sledování peptidů a jejich metabolitů.
• Inteligentní komprese dat (IDC) vedla až k 70 % redukci velikosti souborů, což urychlilo zpracování, přenos i archivaci.
• Pro každý peptid byly stanoveny rozsahy CCS hodnot a koncentrační pokles po 120 min (turnover): od velmi nízkého (anidulafungin) po střední (daptomycin, lanreotide).
• Hlavní biotransformační dráhy zahrnovaly hydrolytickou štěpení, demethylaci a ztrátu charakteristických zbytků (např. chlorbiphenyl u oritavancinu).
• Případová studie daptomycinu umožnila vizualizovat klastrové závislosti odezvy v čase a definovat struktury čtyř hlavních metabolitů pomocí WebMetabase.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow poskytuje integrované řešení pro makromolekulární metabolitickou identifikaci:

• Rychlá a automatizovaná detekce a přiřazení struktur peptidových metabolitů
• Snížení datového zatížení a zrychlené zpracování díky IDC a IMS
• Rozlišení izobarických a matrice přechodů na základě rozdílné iontové mobility

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Propojení strojového učení pro automatizované hodnocení strukturálních hypotéz
• Rozšíření metody na jiné třídy makromolekul (oligonukleotidy, konjugované proteiny)
• Real-time denoising a cloudové platformy pro sdílené pracovní postupy
• Využití vyspělé IMS separace pro ultra­složité biologické vzorky

Závěr

Kombinace iontově mobilitního QTof DIA (HDMSE), inteligentní komprese dat a specializovaného softwaru Mass-MetaSite/WebMetabase představuje efektivní a škálovatelný přístup pro rutinní identifikaci metabolit složitých cyklických peptidů. Workflow zkracuje dobu analýzy, snižuje objem dat a zvyšuje spolehlivost strukturálních interpretací.

Reference

1. Wrona M.D. et al. Somatostatin Analogue Catabolite Screening and Identification Using Vion IMS QTof with WebMetabase, 720006586EN, Waters Corporation.
2. Radchenko V. et al. Software-aided approach to investigate peptide structure and metabolic susceptibility of amide bonds in peptide drugs based on high resolution mass spectrometry, PLOS One, 2017.
3. Mortishire-Smith R. et al. Intelligent Data Capture: Real-Time Noise Reduction for High Resolution Mass Spectrometry, Waters White Paper LITR135023115.