PRINCIPLES AND PRACTICAL ASPECTS OF PREPARATIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Význam tématu

Preparativní kapalinová chromatografie slouží k izolaci a purifikaci cílových sloučenin z komplexních směsí. Na rozdíl od analytické LC, kde se rozdělené sloučeniny zpravidla odvádějí do odpadu nebo destruktivního detektoru, se v preparativní chromatografii frakce hromadí pro další použití. Tento přístup je zásadní pro produkci farmaceuticky a průmyslově hodnotných látek, biochemických meziproduktů a izolaci přírodních produktů, kde je vyžadována vysoká čistota a výtěžnost.

Cíle a přehled studie

Cílem publikace je předložit přehled klíčových principů preparativní LC od volby kolony a konfigurace přístrojů až po strategii škálování a sběr frakcí. Publikace rozlišuje analytické a preparativní použití LC, popisuje komponenty systému, metody měřicí techniky i algoritmy pro rychlý přenos metody z analytické do preparativní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

• Volba kolony – průměry 4,6 až 75 mm, délky 50 až 250 mm, částice 5–10 μm; SAC a DAC komprese pro stabilní balení sorbentu.
• Solventní systémy – nízkotlaké a vysokotlaké míchání pro generování gradientů, vakuové a heliové odplynění.
• Vzorkování – flow-through-needle a fixed-loop autosamplery, multidraw přístup, organická fázová injekce pro velké objemy DMF a DMSO.
• Detekce – UV diodový pole detector (DAD), evaporative light scattering detector (ELSD), hmotnostně selektivní detektor (MSD) s aktivním flow modulátorem.
• Štěpení toku – pasivní T-dělítka a aktivní flow modulátory pro optimalizaci průtoku do detektoru a sběru frakcí.
• Sběr frakcí – časové, polohové, detekčně řízené (práh, derivace) včetně zpožďovacích cívek s minimální disperzí a senzorem objemu zpoždění frakcí.

Hlavní výsledky a diskuse

Publikace objasňuje postupy lineárního a fokusačního škálování ze 4,6 mm analytické kolony na preparativní rozměry 21,2 mm a dále. Klíčové rovnice pro výpočet průtoku, délky isokratické fáze a objemu injekce umožňují zachovat retenci a rozlišení při převodu metod. Optimalizovaný průtok 1,5 mL/min na analytické kolony přináší nejlepší počet teoretických desk a rozlišení. Pro cílené frakce se doporučují zaměřené gradienty zahájené pod a zakončené nad % organické fáze odpovídající retentionímu bodu cílové látky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a opakovatelné přenosy metod mezi systémy různých průměrů kolony.
• Významná úspora rozpouštědel a času díky optimalizovaným průtokům a skórovaným gradientům.
• Možnost automatizace celého workflow včetně výpočtů zaměřených gradientů a řízení sběru frakcí na základě UV, ELS nebo vybrané hmotnostní signatury.
• Flexibilita v použití pro pilotní i výrobní procesy s průtoky od μL/min do stovek mL/min.
• Bezpečnostní prvky – senzory netěsností, nucená extrakce par, kolektory pro nevyužitý objem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj inteligentních softwarových řešení pro návrh a škálování metod, zvyšování automatizace, integrace monolitických a sub-2 μm materiálů pro vyšší kapacitu a separační výkon. Hybridní detekční režimy (MS + DAD + ELSD) a on-line pooling frakcí podle čistoty otevřou nové možnosti pro rychlou sekvenční izolaci rozsáhlých knihoven přípravků.

Závěr

Současné přístupy k preparativní LC staví na kombinaci dobře zdokumentovaných pravidel, modulární instrumentace a sofistikované softwarové podpory. Systematický výběr kolony, optimalizace míchání gradientů, kontrolované převody metod a inteligentní řízení sběru frakcí umožňují vysokou čistotu, výtěžnost a produktivitu v řadě aplikací od farmacie až po průmyslovou analytiku.

Reference

• Mühlebach et al. J Sep Sci. 2011, 34:2983–2988
• Koppitz M. J Comb Chem. 2008, 10:573–579
• Isbell J. J Comb Chem. 2008, 10:150–157
• Guth O. et al. J Comb Chem. 2008, 10:875–882
• Rieck F., Hippler J. Agilent Tech. ToU 5994-0742EN, 2019
• Penduff P. Agilent Tech. ToU 5991-4041EN, 2014
• The LC Handbook. Agilent Tech. 5990-7595EN, 2013
• Guillarme D. et al. Eur J Pharm Biopharm. 2008, 68:430–440
• Schellinger A. P., Carr P. W. J Chromatogr A. 2005, 1077:110–119
• Schoenmakers P.J. et al. J Chromatogr A. 1978, 149:519–537
• Snyder L.R., Dolan J.W. High Performance Gradient Elution. Wiley, 2007
• Jablonski J.-A. M., Wheat T.E., Diehl D.M. Waters app. note Z20002955en, 2009
• Tei A. et al. LCGC Europe. 2013, 26:315–315
• Dolan J.W. LCGC North America. 2013, 31(1):30–35
• Penduff P. Agilent Tech. ToU 5991-2013EN, 2013
• Penduff P., Tei A. Agilent Tech. ToU 5991-6146EN, 2015