Syntetické oligonukleotidy jsou krátké řetězce RNA nebo DNA nejčastěji o počtu 15 až 100 jednotek nukleotidů. Mají široké využití v oblasti výzkumu, v genetice i ve forensních vědách. Tato skupina sloučenin zahrnuje i malé interferující RNA, terapeutické antisense oligonukleotidy, aptamery a CRISPR vodící RNA (CRISPR guide) (1). Tyto látky se vyrábějí synteticky, často s modifikací základní kostry nebo cukru na 2´pozici kvůli stabilitě a farmakologickým účinkům.
Syntéza <a href="https://lcms.cz/library?manufacturerItems=1&amp;search=oligonucleotides">oligonukleotidů</a> je poměrně složitý proces, kdy při jednotlivých cyklech vzniká řada vedlejších produktů. Při vývoji a výrobě těchto látek je proto nezbytná podrobná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace. Charakterizace oligonukleotidů zahrnuje potvrzení jejich molekulové hmotnosti, sekvence nukleotidů, čistoty finálního oligonukleotidu a relativní kvantifikace specifických nečistot. V tomto článku se dozvíte, jaké nástroje nabízí společnost Agilent pro tuto oblast.
<h3>HPLC separace oligonukleotidů</h3>
Chromatografická separace oligonukleotidů se provádí metodami HPLC, nicméně samotná analýza skrývá řadu nástrah. Oligonukleotidy jsou poměrně polární a především obsahují mnoho záporně nabitých fosfátových funkčních skupin. Separace na běžné reverzní fázi není vhodná z důvodu malé retence. LC separace se proto provádí na silných anexech (SAX) ¹’² anebo pomocí iontopárové chromatografie na reverzní fázi (IP-RP) ³’⁴, s triethylaminem jako nejběžnějším iontově párovým činidlem, což je metoda potenciálně kompatibilní i s hmotnostně spektrometrickou detekcí.
Problémem je, že iontopárové činidlo zůstává dlouho v celém LC/MS systému a jeho použití není vhodné v laboratořích, kde je MS detektor využíván i pro jiné aplikace, především v režimu pozitivní ionizace. V nedávno publikovaných aplikačních poznámkách byla s úspěchem použita i separace na chromatografii s hydrofilní-lipofilní interakcí HILIC⁵’⁶, při které se iontopárové činidlo nepoužívá.
Přítomnost velmi polárních fosfátových skupin také vede k negativním sorpčním jevům v běžných HPLC systémech, které obsahují nerezové komponenty. Proto je vhodnější využívat (U)HPLC systémy z ušlechtilých slitin bez přítomnosti železa, které se označují jako biokompatibilní popř. bioinertní. Agilent pro tuto analýzu přímu doporučuje systém <a href="https://lcms.cz/products/468">1290 Infinity II Bio ve variantě UHPLC</a> (1300 bar) nebo <a href="https://lcms.cz/products/467">Prime</a> (800 bar) a <a href="https://lcms.cz/products/185">kolony série AdvanceBio</a>.
<h3>Stanovení čistoty oligonukleotidů</h3>
Získání vysoce čistých syntetických oligonukleotidů není snadné. Platí, že s délkou řetězce cílové molekuly klesá výtěžnost výroby a zvyšuje se podíl nečistot. Nečistoty vzniklé při syntéze zahrnují molekuly s kratším nebo naopak delším nukleotidovým řetězcem, nekompletní thiolací, případně se ztrátou bází. K dalším nečistotám patří produkty konverze fosforothioátů na fosfodiestery, produkty oxidace, enzymové nukleázové degradace nebo nečistoty s přítomností chránících skupin, používaných ve výrobě.
Pro stanovení čistoty oligonukleotidů nabízí Agilent dvě ucelená řešení pomocí metod LC/UV nebo LC/MS, viz obrázek níže. Co se týče MS detektoru, je zde dostačující jednoduchý kvadrupól popřípadě TOF MS, který lze zároveň využít pro profilování nečistot diskutované v následujícím odstavci.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Agilent_reseni_pro_analyzu_oligonukleotidu_bd3cf30bc8/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Agilent-reseni-pro-analyzu-oligonukleotidu.jpg" alt="Altium: Agilent řešení pro analýzu oligonukleotidů"/>
<h3>Potvrzení hmoty produktu a profilování nečistot</h3>
Podrobná charakterizace vzorku obnáší nejen potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu, ale také identifikaci a relativní kvantifikaci nečistot. Vzhledem k rozmanitosti potenciálních nečistot a jejich stopovému množství vůči hlavnímu produktu potřebujeme při profilování nečistot pokročilé analytické metody jako je LC/MS. Zároveň se v rutinní analýze neobejdeme bez pokročilých softwarových nástrojů pro automatické zpracování a interpretaci výsledků. Software <a href="https://lcms.cz/products/176">Agilent MassHunter BioConfirm 12</a> umožňuje analýzu dat pro potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu a stanovení souvisejících nečistot (Target Plus Impurities, TPI). Tento postup využívá MS dat bez fragmentace, která lze měřit na jednoduchém <a href="https://lcms.cz/products/174">TOF MS detektoru Agilent 6230B</a>. Obrázek níže znázorňuje tento postup. Na dalším obrázku níže je ilustrace zobrazení výsledků této analýzy v software BioConfirm. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce ⁷.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Target_Plus_Impurities_TPI_analyticky_postup_v_Mass_Hunter_Bio_Confirm_12_0_72f2a234a3/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Target-Plus-Impurities-(TPI)-analyticky-postup-v-MassHunter-BioConfirm-12.0.jpg" alt="Altium: Target Plus Impurities (TPI) analytický postup v MassHunter BioConfirm 12.0"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Zobrazeni_vysledku_Target_Plus_Impurities_TPI_analytickeho_postupu_v_Mass_Hunter_Bio_Confirm_12_0_f13281ed57/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Zobrazeni-vysledku-Target-Plus-Impurities-(TPI)-analytickeho-postupu-v-MassHunter-BioConfirm-12.0.jpg" alt="Altium: Zobrazení výsledků Target Plus Impurities (TPI) analytického postupu v MassHunter BioConfirm 12.0"/>
<h3>Konfirmace sekvence oligonukleotidu</h3>
Pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu se pro cílový oligonukleotid změří MS/MS data s vysokým rozlišením a přesnou hmotou systémem LC/QTOF MS. Software MassHunter BioConfirm 12 potom „namapuje“ tato MS/MS data na předpokládané fragmenty vypočtené z uživatelem zadané sekvence nukleotidů a odpoví na otázku, jak dobře se shoduje skutečná sekvence s tou předpokládanou (pokrytí sekvence, sequence coverage). To je možné díky tomu, že z oligonukleotidové sekvence mohou vznikat pouze určité typy fragmentů – viz Obrázek níže. Software BioConfirm vypočte sumární vzorce všech předpokládaných fragmentů z dané sekvence, tyto fragmenty potom cíleně hledá v MS/MS spektru a zobrazí jejich detekci na tzv. Fragment confirmation ladder - viz další obrázek níže. Na základě toho je kvantifikováno pokrytí sekvence (viz následující obrázek níže) a jsou zjištěny strukturní modifikace sekvence i v situaci, že celková molekulová hmotnost je identická. Postup pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu naleznete na schematu v Obrázku níže. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce⁸.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_A_Nomenklatura_fragmentace_oligonukleotidu_B_Anotace_oligonukleotidu_8bbca73253/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu_A" alt="Altium: A) Nomenklatura fragmentace oligonukleotidů. B) Anotace oligonukleotidů (Fragment confirmation ladder). Barvy písmen reprezentují různé typy fragmentů identifikované a označené v MS/MS spektru"/>-Nomenklatura-fragmentace-oligonukleotidu-B)-Anotace-oligonukleotidu.jpg)
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Priklad_LC_MS_MS_spektra_20_meru_and_21_meru_RNA_se_zobrazenim_nalezenych_typu_fragmentu_0807f168d2/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Priklad-LC-MS-MS-spektra-20-meru-and-21-meru-RNA-se-zobrazenim-nalezenych-typu-fragmentu.jpg" alt="Altium: Příklad LC/MS/MS spektra 20-meru and 21-meru RNA se zobrazením nalezených typů fragmentů"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Analyticky_postup_pro_konfirmaci_sekvence_v_Mass_Hunter_Bio_Confirm_12_0_ea407766b2/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Analyticky-postup-pro-konfirmaci-sekvence-v-MassHunter-BioConfirm-12.0.jpg" alt="Altium: Analytický postup pro konfirmaci sekvence v MassHunter BioConfirm 12.0"/>
<h3>Purifikace oligonukleotidů</h3>
Kromě portfolia pro analýzu oligonukleotidů nabízí Agilent také celé řešení pro jejich purifikaci. Uživatel může volit purifikační systém v širokém rozsahu od analytického měřítka až po preparativní. Kromě samotné instrumentace jsou k dispozici také kolony, software a hotové metody ⁹ˉ¹¹. Preparativní systémy jsou samozřejmě v bioinertním nebo biokompatibilním provedení jako <a href="https://lcms.cz/products/466">Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert</a> nebo <a href="https://lcms.cz/products/468">1290 Infinity II Bio LC</a>.
[1] CRISPR je nedávno objevená technika genetického inženýrství, kterou lze modifikovat genomy živých organismů. Do buňky se dodá nukleasa Cas9 spojená se syntetickou vodicí RNA (gRNA) a genom buňky je možné štěpit na požadovaném místě.

Analýza a purifikace syntetických oligonukleotidů od začátku do konce. Od výzkumu a vývoje po produkční QA/QC

Přehled posterů Agilent ASMS 2025 zaměřených na LC/TOF

<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://gcms.cz/companies/37">Altium International s.r.o.</a> je jednou z největších obchodních společností na českém trhu v oblasti přístrojů pro analytickou chemii, laboratorního vybavení a spotřebního materiálu. Vedle oddělení chromatografie, hmotnostní spektrometrie a spektroskopie máme také rychle rostoucí divizi molekulární biologie, genetiky a buněčné patologie. Nedílnou součástí naší nabídky je servis a aplikační podpora zákazníkům.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_tym_Altium_93271f079b.jpg" alt="Altium International: Tým Altium" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Altium_tym_Altium_93271f079b.jpg 208w," sizes="100vw" width="1600" height="1200">V současné době rozšiřuje Altium tým aplikačních specialistů a hledá vhodného kandidáta na pozici:<h3>Aplikační specialista/ka pro oblast LC a LCMS</h3><h4>Řekli byste o sobě toto?</h4><ul><li>Baví mě analytická chemie a přístroje</li><li>Mám rád, když je moje práce pestrá a přináší řešení rozmanitých analytických úkolů a problémů</li><li>Rád komunikuji s lidmi v oboru a získávám nové znalosti</li><li>Chci pracovat v profesionálním a spolupracujícím týmu</li></ul>Pokud ano, tak určitě čtěte dále:<h4>Co tato role zahrnuje?</h4><ul><li>Podporu zákazníků při vývoji, optimalizaci a troubleshootingu analytických metod — od HPLC a LC/MS/MS po high-resolution MS (QTOF).</li><li>Demonstrace přístrojů a software nebo demo měření před prodejem přístroje</li><li>Školení, konzultační a poradenskou činnost</li><li>Odborné prezentace na seminářích a vědeckých konferencích</li><li>Pokrytí klíčových aplikačních oblastí: bezpečnost potravin, životní prostředí (PFAS, pesticidy), farmaceutická a klinická chemie</li><li>Místo výkonu práce: Praha Vysočany</li></ul><h4>Jaké podmínky a zázemí nabízíme?</h4><ul><li>Špičkově vybavenou laboratoř GC/MS a LC/MS instrumentací</li><li>Krásné pracovní prostředí v nově zrekonstruované vile</li><li>Dobrou atmosféru v týmu, zvyklém spolupracovat</li><li>Výborné platové ohodnocení zohledňující Vaše vzdělání a dosavadní zkušenosti (fixní plat a k tomu bonusový program)</li><li>5 týdnů dovolené</li><li>Notebook, mobilní telefon, služební auto, multisport kartu, stravenky</li></ul><h4>Co od Vás očekáváme?</h4><ul><li>Vysokoškolské nebo postgraduální vzdělání v analytické chemii, biochemii nebo příbuzném oboru (Ing./Mgr./Ph.D.)</li><li>Praxi v laboratoři a zkušenost s vývojem LC a LC/MS metod, schopnost samostatně vyvíjet metody a komunikovat výsledky zákazníkům v češtině i angličtině</li><li>Orientaci v alespoň jedné aplikační oblasti — bezpečnost potravin, environmentální analýza (pesticidy, PFAS), farmaceutická/klinická chemie nebo analýza biologických léčiv — hlubší znalosti v dané oblasti výhodou</li><li>Zkušenost s HRMS QTOF a/nebo tandemovou hmotnostní spektrometrií (QQQ) — výhodou</li><li>Prezentace na seminářích či konferencích</li><li>Přirozeně komunikující a samostatnou osobnost se smyslem pro zodpovědnost za výsledek</li><li>Rodilý mluvčí - výborná znalost češtiny&nbsp;</li><li>Dobrou znalost angličtiny slovem i písmem</li><li>Znalost LC-MS softwaru (<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/23">Agilent MassHunter</a>, <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/24">OpenLab CDS</a> nebo ekvivalent) — výhodou</li><li>Řidičský průkaz skupiny B</li></ul><blockquote><h5>Kontakt:</h5>Jitka Zrostlíková<ul><li>Tel.: 606 047 034</li><li>E-mail: jitka.zrostlikova@altium.net&nbsp;</li></ul></blockquote>

Altium hledá Aplikačního specialistu pro LC a LC/MS

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Poster

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Je autorizovaným distributorem společnosti Agilent Technologies pro Českou republiku v oblastech chromatografie (GC, HPLC, UHPLC, kapilární elektroforéza) a hmotnostní spektrometrie (GC/MS, LC/MS, CE/MS), disolučních aparátů, molekulární (UV-Vis, UV-Vis-NIR, fluorescence, FTIR analyzátory a mikroskopy) a atomové spektroskopie (ICP-OES, ICP-MS, AAS), a v neposlední řadě také v oblasti molekulární biologie a genomiky (analýza nukleových kyselin a proteinů, microarray skenery a skla, PCR & RT-PCR, qPCR, řešení pro NGS, reagencie pro mutagenezi a klonování, sondy FISH a další).

Altium International

Odběry vzorků 2026

ISC 2026 - the 35th International Symposium on Chromatography

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Measuring Diverse Samples with UV/VIS Spectrometers and Integrating Spheres

Insights from an IC specialist: To be suppressed or not suppressed?

Advancing Proteomics with ZenoTOF: From Single-Cell Analysis to Plasma Biomarker Discovery