Syntetické oligonukleotidy jsou krátké řetězce RNA nebo DNA nejčastěji o počtu 15 až 100 jednotek nukleotidů. Mají široké využití v oblasti výzkumu, v genetice i ve forensních vědách. Tato skupina sloučenin zahrnuje i malé interferující RNA, terapeutické antisense oligonukleotidy, aptamery a CRISPR vodící RNA (CRISPR guide) (1). Tyto látky se vyrábějí synteticky, často s modifikací základní kostry nebo cukru na 2´pozici kvůli stabilitě a farmakologickým účinkům.
Syntéza <a href="https://lcms.cz/library?manufacturerItems=1&amp;search=oligonucleotides">oligonukleotidů</a> je poměrně složitý proces, kdy při jednotlivých cyklech vzniká řada vedlejších produktů. Při vývoji a výrobě těchto látek je proto nezbytná podrobná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace. Charakterizace oligonukleotidů zahrnuje potvrzení jejich molekulové hmotnosti, sekvence nukleotidů, čistoty finálního oligonukleotidu a relativní kvantifikace specifických nečistot. V tomto článku se dozvíte, jaké nástroje nabízí společnost Agilent pro tuto oblast.
<h3>HPLC separace oligonukleotidů</h3>
Chromatografická separace oligonukleotidů se provádí metodami HPLC, nicméně samotná analýza skrývá řadu nástrah. Oligonukleotidy jsou poměrně polární a především obsahují mnoho záporně nabitých fosfátových funkčních skupin. Separace na běžné reverzní fázi není vhodná z důvodu malé retence. LC separace se proto provádí na silných anexech (SAX) ¹’² anebo pomocí iontopárové chromatografie na reverzní fázi (IP-RP) ³’⁴, s triethylaminem jako nejběžnějším iontově párovým činidlem, což je metoda potenciálně kompatibilní i s hmotnostně spektrometrickou detekcí.
Problémem je, že iontopárové činidlo zůstává dlouho v celém LC/MS systému a jeho použití není vhodné v laboratořích, kde je MS detektor využíván i pro jiné aplikace, především v režimu pozitivní ionizace. V nedávno publikovaných aplikačních poznámkách byla s úspěchem použita i separace na chromatografii s hydrofilní-lipofilní interakcí HILIC⁵’⁶, při které se iontopárové činidlo nepoužívá.
Přítomnost velmi polárních fosfátových skupin také vede k negativním sorpčním jevům v běžných HPLC systémech, které obsahují nerezové komponenty. Proto je vhodnější využívat (U)HPLC systémy z ušlechtilých slitin bez přítomnosti železa, které se označují jako biokompatibilní popř. bioinertní. Agilent pro tuto analýzu přímu doporučuje systém <a href="https://lcms.cz/products/468">1290 Infinity II Bio ve variantě UHPLC</a> (1300 bar) nebo <a href="https://lcms.cz/products/467">Prime</a> (800 bar) a <a href="https://lcms.cz/products/185">kolony série AdvanceBio</a>.
<h3>Stanovení čistoty oligonukleotidů</h3>
Získání vysoce čistých syntetických oligonukleotidů není snadné. Platí, že s délkou řetězce cílové molekuly klesá výtěžnost výroby a zvyšuje se podíl nečistot. Nečistoty vzniklé při syntéze zahrnují molekuly s kratším nebo naopak delším nukleotidovým řetězcem, nekompletní thiolací, případně se ztrátou bází. K dalším nečistotám patří produkty konverze fosforothioátů na fosfodiestery, produkty oxidace, enzymové nukleázové degradace nebo nečistoty s přítomností chránících skupin, používaných ve výrobě.
Pro stanovení čistoty oligonukleotidů nabízí Agilent dvě ucelená řešení pomocí metod LC/UV nebo LC/MS, viz obrázek níže. Co se týče MS detektoru, je zde dostačující jednoduchý kvadrupól popřípadě TOF MS, který lze zároveň využít pro profilování nečistot diskutované v následujícím odstavci.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Agilent_reseni_pro_analyzu_oligonukleotidu_bd3cf30bc8/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Agilent-reseni-pro-analyzu-oligonukleotidu.jpg" alt="Altium: Agilent řešení pro analýzu oligonukleotidů"/>
<h3>Potvrzení hmoty produktu a profilování nečistot</h3>
Podrobná charakterizace vzorku obnáší nejen potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu, ale také identifikaci a relativní kvantifikaci nečistot. Vzhledem k rozmanitosti potenciálních nečistot a jejich stopovému množství vůči hlavnímu produktu potřebujeme při profilování nečistot pokročilé analytické metody jako je LC/MS. Zároveň se v rutinní analýze neobejdeme bez pokročilých softwarových nástrojů pro automatické zpracování a interpretaci výsledků. Software <a href="https://lcms.cz/products/176">Agilent MassHunter BioConfirm 12</a> umožňuje analýzu dat pro potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu a stanovení souvisejících nečistot (Target Plus Impurities, TPI). Tento postup využívá MS dat bez fragmentace, která lze měřit na jednoduchém <a href="https://lcms.cz/products/174">TOF MS detektoru Agilent 6230B</a>. Obrázek níže znázorňuje tento postup. Na dalším obrázku níže je ilustrace zobrazení výsledků této analýzy v software BioConfirm. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce ⁷.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Target_Plus_Impurities_TPI_analyticky_postup_v_Mass_Hunter_Bio_Confirm_12_0_72f2a234a3/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Target-Plus-Impurities-(TPI)-analyticky-postup-v-MassHunter-BioConfirm-12.0.jpg" alt="Altium: Target Plus Impurities (TPI) analytický postup v MassHunter BioConfirm 12.0"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Zobrazeni_vysledku_Target_Plus_Impurities_TPI_analytickeho_postupu_v_Mass_Hunter_Bio_Confirm_12_0_f13281ed57/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Zobrazeni-vysledku-Target-Plus-Impurities-(TPI)-analytickeho-postupu-v-MassHunter-BioConfirm-12.0.jpg" alt="Altium: Zobrazení výsledků Target Plus Impurities (TPI) analytického postupu v MassHunter BioConfirm 12.0"/>
<h3>Konfirmace sekvence oligonukleotidu</h3>
Pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu se pro cílový oligonukleotid změří MS/MS data s vysokým rozlišením a přesnou hmotou systémem LC/QTOF MS. Software MassHunter BioConfirm 12 potom „namapuje“ tato MS/MS data na předpokládané fragmenty vypočtené z uživatelem zadané sekvence nukleotidů a odpoví na otázku, jak dobře se shoduje skutečná sekvence s tou předpokládanou (pokrytí sekvence, sequence coverage). To je možné díky tomu, že z oligonukleotidové sekvence mohou vznikat pouze určité typy fragmentů – viz Obrázek níže. Software BioConfirm vypočte sumární vzorce všech předpokládaných fragmentů z dané sekvence, tyto fragmenty potom cíleně hledá v MS/MS spektru a zobrazí jejich detekci na tzv. Fragment confirmation ladder - viz další obrázek níže. Na základě toho je kvantifikováno pokrytí sekvence (viz následující obrázek níže) a jsou zjištěny strukturní modifikace sekvence i v situaci, že celková molekulová hmotnost je identická. Postup pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu naleznete na schematu v Obrázku níže. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce⁸.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_A_Nomenklatura_fragmentace_oligonukleotidu_B_Anotace_oligonukleotidu_8bbca73253/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu_A" alt="Altium: A) Nomenklatura fragmentace oligonukleotidů. B) Anotace oligonukleotidů (Fragment confirmation ladder). Barvy písmen reprezentují různé typy fragmentů identifikované a označené v MS/MS spektru"/>-Nomenklatura-fragmentace-oligonukleotidu-B)-Anotace-oligonukleotidu.jpg)
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Priklad_LC_MS_MS_spektra_20_meru_and_21_meru_RNA_se_zobrazenim_nalezenych_typu_fragmentu_0807f168d2/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Priklad-LC-MS-MS-spektra-20-meru-and-21-meru-RNA-se-zobrazenim-nalezenych-typu-fragmentu.jpg" alt="Altium: Příklad LC/MS/MS spektra 20-meru and 21-meru RNA se zobrazením nalezených typů fragmentů"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Analyza_a_purifikace_syntetickych_oligonukleotidu_od_zacatku_do_konce_Od_vyzkumu_a_vyvoje_po_produkcni_QA_QC_Analyticky_postup_pro_konfirmaci_sekvence_v_Mass_Hunter_Bio_Confirm_12_0_ea407766b2/Altium:-Analyza-a-purifikace-syntetickych-oligonukleotidu-od-zacatku-do-konce.-Od-vyzkumu-a-vyvoje-po-produkcni-QA-QC_Analyticky-postup-pro-konfirmaci-sekvence-v-MassHunter-BioConfirm-12.0.jpg" alt="Altium: Analytický postup pro konfirmaci sekvence v MassHunter BioConfirm 12.0"/>
<h3>Purifikace oligonukleotidů</h3>
Kromě portfolia pro analýzu oligonukleotidů nabízí Agilent také celé řešení pro jejich purifikaci. Uživatel může volit purifikační systém v širokém rozsahu od analytického měřítka až po preparativní. Kromě samotné instrumentace jsou k dispozici také kolony, software a hotové metody ⁹ˉ¹¹. Preparativní systémy jsou samozřejmě v bioinertním nebo biokompatibilním provedení jako <a href="https://lcms.cz/products/466">Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert</a> nebo <a href="https://lcms.cz/products/468">1290 Infinity II Bio LC</a>.
[1] CRISPR je nedávno objevená technika genetického inženýrství, kterou lze modifikovat genomy živých organismů. Do buňky se dodá nukleasa Cas9 spojená se syntetickou vodicí RNA (gRNA) a genom buňky je možné štěpit na požadovaném místě.

Analýza a purifikace syntetických oligonukleotidů od začátku do konce. Od výzkumu a vývoje po produkční QA/QC

Přehled posterů Agilent ASMS 2025 zaměřených na LC/TOF

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Poster

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Je autorizovaným distributorem společnosti Agilent Technologies pro Českou republiku v oblastech chromatografie (GC, HPLC, UHPLC, kapilární elektroforéza) a hmotnostní spektrometrie (GC/MS, LC/MS, CE/MS), disolučních aparátů, molekulární (UV-Vis, UV-Vis-NIR, fluorescence, FTIR analyzátory a mikroskopy) a atomové spektroskopie (ICP-OES, ICP-MS, AAS), a v neposlední řadě také v oblasti molekulární biologie a genomiky (analýza nukleových kyselin a proteinů, microarray skenery a skla, PCR & RT-PCR, qPCR, řešení pro NGS, reagencie pro mutagenezi a klonování, sondy FISH a další).

Altium International

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material