<h3><strong>Cíl práce</strong></h3>
<p>Na platformě ověřené komerční metody fy <a href="https://lcms.cz/products?manufacturerItems=56"><strong>RECIPE</strong></a> pro stanovení <a href="https://lcms.cz/library?search=d%E2%82%82%252fd%E2%82%83&amp;manufacturerItems=53">25-hydroxy-vitaminů D₂/D₃</a> v plasmě či séru vyvinout robustní a spolehlivou metodu DBS, která je pro pacienta atraktivní s ohledem na korespondenční formu méně invazivního odběru vzorků.</p>
<h3><strong>Úvod</strong></h3>
<p>„Vitamín D“ zahrnuje skupinu steroidů, které hrají klíčovou roli v inkorporaci vápníku do kostní hmoty, v buněčné proliferaci, pozitivní vliv vyšších hladin ergokalciferolu (D₂) zejména cholekalciferolu (D₃) na úroveň humorální imunitní připravenosti organismu a modulaci jeho protizánětlivé odpovědi (v konotaci s vážnými průběhy COVID-19 – cytokinová bouře – velmi pozoruhodná role!). V prevenci i pozitivní vliv na DM I. i II. typu, homeostasis TK,…</p>
<h5><strong>Mimotělní zdroje vitaminu D₂:</strong></h5>
<ul>
<li>sušené houby (UV – na slunci)</li>
<li>kvasinky (S. cerevisiae) – kvasnice (český chléb)</li>
</ul>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Ergosterol_zdroj_vitaminu_D2_houby_S_cerevisiae_2d3deee692/Ergosterol-zdroj-vitaminu-D2-(houby-S.cerevisiae).png" alt="Ergosterol – zdroj vitaminu D₂ (houby, S.cerevisiae)"/></p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/ADAPTACE_METODY_RECIPE_VITAMIN_D2_D3_IN_PLASMA_AND_SERUM_1_d98e173213/ADAPTACE-METODY-RECIPE-VITAMIN-D2-D3-IN-PLASMA-AND-SERUM-1.png" alt=""/></p>
<h5><strong>Mimotělní zdroje vitaminu D₃:</strong></h5>
<ul>
<li><strong>Potraviny živočišného původu</strong> (ryby, zejména tresčí játra)</li>
<li><strong>Potraviny rostlinného původu</strong> – č. Solanaceae – zejména rajčata a brambory, obsah D₃ a 7-dehydrocholesterolu klesá ve směru: listy – plody – stonky - oddenky(hlízy)</li>
<li><strong>Obiloviny</strong> (zejména oves), tzv. fortifikovaná rostlinná mléka (ovesné, mandlové, kokosové)</li>
</ul>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/ADAPTACE_METODY_RECIPE_VITAMIN_D2_D3_IN_PLASMA_AND_SERUM_2_6f7343a2f9/ADAPTACE-METODY-RECIPE-VITAMIN-D2-D3-IN-PLASMA-AND-SERUM-2.png" alt="Cholekalciferol - zdroj vitamínu D₃ (Potraviny živočišného a rostlinného původu, Obiloviny)"/></p>
<p>Biologicky Aktivní formy jsou steroly: 25(OH)D2, 25(OH)D3 - biosynthesa v játrech 1α,25(OH)2D2/D3 – biosynthesa v ledvinách (KALCITRIOL) - přes 25(OH)D2/D3 (stimulace parathormonem – příštítná tělíska).</p>
<p>Dostatečná expozice slunečnímu světlu (UV-B) znamená rychlou biosynthesu (konverzi) D₂ na klíčový D₃. V zimním a časném jarním období klimatu mírného pásma je potom vhodná dieta bohatá na kalciferol nezbytná pro udržení dostatečné imunitní obranyschopnosti. Optimální denní dávka vitaminu D₃ ve věkovém rozpětí 1 – 70 let bez ohledu na pohlaví je 15 µg (Zákon č. 352/2009 Sb. ,DDD je od 25 let věku výše jen 5 µg). Aktivní metabolit 1,25-dihydroxycholekalciferol hraje důležitou regulační roli v produkci antimikrobiálních peptidů (např. katelicidinu). Kalcitriol je steroidní hormon přes parathormon (hydroxylace v tkáni ledvin) zajišťuje biologickou dostupnost vápníku pro jeho inkorporaci do kostní hmoty.</p>
<ul>
<li><strong>VITAMIN D₂</strong> – ERGOKALCIFEROL </li>
<li><strong>VITAMIN D₃</strong> – CHOLEKALCIFEROL</li>
</ul>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Tvorba_D3_ze_7_dehydrocholesterolu_v_kuzi_obratlovcu_vcetne_cloveka_76c2efedb9/Tvorba-D3-ze-7-dehydrocholesterolu-v-kuzi-obratlovcu-vcetne-cloveka.png" alt="Tvorba D3 ze 7-dehydrocholesterolu v kůži obratlovců včetně člověka."/></p>
<h3><strong>Kalibrace</strong></h3>
<p>Kalibrováno na <a href="https://lcms.cz/products/136"><strong>ClinCal® Calibrator RECIPE</strong></a> (0 – 197 nmol/l/D₃ , r² = 0.9964, 0 – 196 nmol/l/D₂, r² = 0.9954 kontrolováno pomocí ClinChek® - Control (serum, Level I s cílovou hodnotou 35.5 nmol/l, bias 11% pro D₂ , s cílovou hodnotou 37.1 nmol/l, bias 9.4% pro D₃ , Level II s cílovou hodnotou 103.0 nmol/l, bias 6.3% pro D₂ , s cílovou hodnotou 105.0 nmol/l, bias 4.6 % pro D₃ ).</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Kalibrace_na_Clin_Cal_Calibrator_RECIPE_a16b9dc858/Kalibrace-na-ClinCal(r)-Calibrator-RECIPE.png" alt="Kalibrace na ClinCal® Calibrator RECIPE"/></p>
<h3><strong>Preanalytická fáze</strong></h3>
<h5><strong>Odběr vzorků DBS CAPITAINER (Sweden)</strong>:</h5>
<p>Kapka kapilární krve z prstu dobrovolníka byla aplikována na startovací pozici speciální odběrové soupravy fy Capitainer (Quantitative blood sampling card Capitainer B, The quantitative DBS system) zkoncentrována na produktový disk, který byl použit k vlastní analýze.</p>
<h3><strong>Analytická metodika</strong></h3>
<h5><strong>1. Počáteční příprava analytického vzorku:</strong></h5>
<p>K extrakci z disku DBS byl použit roztok RECIPE Precipitant P/IS (d6-25-OH-D₃, parent iont 389.368 m/z) o objemu 200µl vortex 90 minut, centrifugace 15000 ot/min po dobu 5 minut, 10 minut inkubace při 4°C, opět centrifugace při stejných podmínek jako v prvé a nástřik 50 µl výsledného supernatantu přímo na systém UHPLC/HRMS. Na základě studia výtěžnosti byl čas vortexování ustálen až na 6 hodinách, objem P/IS 400 µl, poté následovala již jen centrifugace za stejných podmínek bez inkubace.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Odber_a_priprava_analytickeho_vzorku_DBS_CAPITAINER_a_RECIPE_1_fe84bdc833/Odber-a-priprava-analytickeho-vzorku-DBS-CAPITAINER-a-RECIPE-1.jpg" alt="Odběr a příprava analytického vzorku DBS CAPITAINER a RECIPE"/></p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Odber_a_priprava_analytickeho_vzorku_DBS_CAPITAINER_a_RECIPE_2_ad9a6e3dff/Odber-a-priprava-analytickeho-vzorku-DBS-CAPITAINER-a-RECIPE-2.jpg" alt="Odběr a příprava analytického vzorku DBS CAPITAINER a RECIPE"/></p>
<h5><strong>2. Počáteční příprava analytického vzorku</strong></h5>
<p>Celý proces byl také zkoušen na systému 10539735 fy Whatman. Terčíky určené pro novorozenecký screening (filtrační papír s vyšším obsahem celulózy). Poněvadž se jedná o mnohem tenčí sací vrstvu může být doba vortexování oproti systému fy Capitainer zkrácena na dobu maximálně 3 hodin, doba 2 hodin již postačí.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Odber_a_priprava_analytickeho_vzorku_Whatman_e87a691265/Odber-a-priprava-analytickeho-vzorku-Whatman.jpg" alt="Odběr a příprava analytického vzorku Whatman"/></p>
<h5><strong>3. UHPLC/HRMS</strong></h5>
<p>Systém Q EXACTIVE FOCUS (Thermo Fisher Scientific) v režimu plného skenu (full scan) Optimalizován v režimu Tune na MS7014 RECIPE® Optimisation Mix (parentní ionty: 395.325 - D₂, 383.331 - D₃). </p>
<p>UHPLC Ultima 3000, kolona LUNA® Omega, 1.6µm Polar C18, 50 x 2.1mm.</p>
<h3><strong>Výsledky</strong></h3>
<p>Ve vzorcích DBS u první skupiny 8 dobrovolníků stanoven D₃ v rozsahu hodnot 22.56 – 93.56 nmol/l bez přepočtu na hematokrit D₂ v těchto vzorkách detekován nebyl. Po optimalizaci doby třepání ad1. byla pro ověření na reálném vzorku DBS testována krev dobrovolnice s již podstatně vyšší hodnotou (62.57 nmol/l) a dále měřeny další DBS. Druhá skupina 7 dobrovolníků porovnány hodnoty v séru vs. DBS.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RECIPE_Clin_Chek_Serum_Control_Level_I_mean_value_14_7_14_9_mg_L_a_Venozni_krev_muz_roc_1993_d32f615d10/RECIPE-ClinChek(r)-Serum-Control-Level-I-(mean-value-147-14.9-mg-L)-a-Venozni-krev-muz-roc.-1993.png" alt="RECIPE ClinChek® - Serum Control, Level I (mean value  14,7-14.9 μg-L) a Venózní krev, muž, roč. 1993"/></p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Vysledky_analyzy_vzorku_DBS_u_prvni_skupiny_8_dobrovolniku_47d4170b5b/Vysledky-analyzy-vzorku-DBS-u-prvni-skupiny-8-dobrovolniku.png" alt="Výsledky analýzy vzorků DBS u první skupiny 8 dobrovolníků"/></p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Porovnani_hodnoty_v_seru_vs_DBS_skupiny_7_dobrovolniku_5aa2745fcd/Porovnani-hodnoty-v-seru-vs.-DBS-skupiny-7-dobrovolniku.png" alt="Porovnání hodnoty v séru vs. DBS skupiny 7 dobrovolníků"/></p>
<h3><strong>Diskuze a závěr</strong></h3>
<p>Za optimální hladiny vitamínu D₂/D₃ jsou četnými odborníky považovány hladiny v plasmě/séru kolem 100 nmol/l a vyšší. Avšak v evropské populaci včetně naší jsou nalézány hodnoty bohužel běžně nižší než 50 nmol/l. </p>
<p>Poznatky z prvé fáze vývoje metody byly úspěšně využity v nyní probíhající validační fázi, která zahrnovala přípravu 50 µl aliquotů rekonstituovaných kalibrátorů a kontrol hlubokým zmrazením na -70 °C a jejich postupné proměřování v DBS režimu Capitainer a Whatman Validace DBS kalibrací bez nutnosti stanovení konvergenčního faktoru (kapalné vzorky v. DBS/kapilární krev v. krev venózní) z prvé fáze vývoje metody bude nutným předpokladem použití metody v rutinním režimu monitorování DBS vzorků širší populace zejména v rámci. </p>
<p>Nevýhoda Whatman terčíků oproti Capitainer diskům - větší poloměr, nutnost celý terčík rozštípat speciálními štípacími kleštěmi na poměrně velký počet malých dílčích terčíků → prodloužení doby centrifugace a celkové doby zpracování vzorku před extrakcí. Nízké nálezy D₂ jdou evidentně na konto kvality nutrice dobrovolníků/pacientů (i když prozatím statisticky nevýznamný počet), viz přirozené zdroje D₂/D₃.</p>


Adaptace metody RECIPE® 25-OH-VITAMIN D2/D3 in plasma and serum – ON LINE analysis pro vzorky suché krevní skvrny (DBS)

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Je společnost zabývající se výzkumem a vývojem, prodejem a aplikační podporou chromatografických metod včetně chromatografického spotřebního materiálu. Společnost je organizátorem mezinárodní konference INDC a konference VITATOX.

RADANAL

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material