Adaptace metody RECIPE® 25-OH-VITAMIN D2/D3 in plasma and serum – ON LINE analysis pro vzorky suché krevní skvrny (DBS)

Cíl práce

Na platformě ověřené komerční metody fy RECIPE pro stanovení 25-hydroxy-vitaminů D₂/D₃ v plasmě či séru vyvinout robustní a spolehlivou metodu DBS, která je pro pacienta atraktivní s ohledem na korespondenční formu méně invazivního odběru vzorků.

Úvod

„Vitamín D“ zahrnuje skupinu steroidů, které hrají klíčovou roli v inkorporaci vápníku do kostní hmoty, v buněčné proliferaci, pozitivní vliv vyšších hladin ergokalciferolu (D₂) zejména cholekalciferolu (D₃) na úroveň humorální imunitní připravenosti organismu a modulaci jeho protizánětlivé odpovědi (v konotaci s vážnými průběhy COVID-19 – cytokinová bouře – velmi pozoruhodná role!). V prevenci i pozitivní vliv na DM I. i II. typu, homeostasis TK,…

Mimotělní zdroje vitaminu D₂:

• sušené houby (UV – na slunci)
• kvasinky (S. cerevisiae) – kvasnice (český chléb)

Ergosterol – zdroj vitaminu D₂ (houby, S.cerevisiae)

Mimotělní zdroje vitaminu D₃:

• Potraviny živočišného původu (ryby, zejména tresčí játra)
• Potraviny rostlinného původu – č. Solanaceae – zejména rajčata a brambory, obsah D₃ a 7-dehydrocholesterolu klesá ve směru: listy – plody – stonky - oddenky(hlízy)
• Obiloviny (zejména oves), tzv. fortifikovaná rostlinná mléka (ovesné, mandlové, kokosové)

Cholekalciferol - zdroj vitamínu D₃ (Potraviny živočišného a rostlinného původu, Obiloviny)

Biologicky Aktivní formy jsou steroly: 25(OH)D2, 25(OH)D3 - biosynthesa v játrech 1α,25(OH)2D2/D3 – biosynthesa v ledvinách (KALCITRIOL) - přes 25(OH)D2/D3 (stimulace parathormonem – příštítná tělíska).

Dostatečná expozice slunečnímu světlu (UV-B) znamená rychlou biosynthesu (konverzi) D₂ na klíčový D₃. V zimním a časném jarním období klimatu mírného pásma je potom vhodná dieta bohatá na kalciferol nezbytná pro udržení dostatečné imunitní obranyschopnosti. Optimální denní dávka vitaminu D₃ ve věkovém rozpětí 1 – 70 let bez ohledu na pohlaví je 15 µg (Zákon č. 352/2009 Sb. ,DDD je od 25 let věku výše jen 5 µg). Aktivní metabolit 1,25-dihydroxycholekalciferol hraje důležitou regulační roli v produkci antimikrobiálních peptidů (např. katelicidinu). Kalcitriol je steroidní hormon přes parathormon (hydroxylace v tkáni ledvin) zajišťuje biologickou dostupnost vápníku pro jeho inkorporaci do kostní hmoty.

• VITAMIN D₂ – ERGOKALCIFEROL
• VITAMIN D₃ – CHOLEKALCIFEROL

Tvorba D3 ze 7-dehydrocholesterolu v kůži obratlovců včetně člověka.

Kalibrace

Kalibrováno na ClinCal® Calibrator RECIPE (0 – 197 nmol/l/D₃ , r² = 0.9964, 0 – 196 nmol/l/D₂, r² = 0.9954 kontrolováno pomocí ClinChek® - Control (serum, Level I s cílovou hodnotou 35.5 nmol/l, bias 11% pro D₂ , s cílovou hodnotou 37.1 nmol/l, bias 9.4% pro D₃ , Level II s cílovou hodnotou 103.0 nmol/l, bias 6.3% pro D₂ , s cílovou hodnotou 105.0 nmol/l, bias 4.6 % pro D₃ ).

Kalibrace na ClinCal® Calibrator RECIPE

Preanalytická fáze

Odběr vzorků DBS CAPITAINER (Sweden):

Kapka kapilární krve z prstu dobrovolníka byla aplikována na startovací pozici speciální odběrové soupravy fy Capitainer (Quantitative blood sampling card Capitainer B, The quantitative DBS system) zkoncentrována na produktový disk, který byl použit k vlastní analýze.

Analytická metodika

1. Počáteční příprava analytického vzorku:

K extrakci z disku DBS byl použit roztok RECIPE Precipitant P/IS (d6-25-OH-D₃, parent iont 389.368 m/z) o objemu 200µl vortex 90 minut, centrifugace 15000 ot/min po dobu 5 minut, 10 minut inkubace při 4°C, opět centrifugace při stejných podmínek jako v prvé a nástřik 50 µl výsledného supernatantu přímo na systém UHPLC/HRMS. Na základě studia výtěžnosti byl čas vortexování ustálen až na 6 hodinách, objem P/IS 400 µl, poté následovala již jen centrifugace za stejných podmínek bez inkubace.

Odběr a příprava analytického vzorku DBS CAPITAINER a RECIPE

Odběr a příprava analytického vzorku DBS CAPITAINER a RECIPE

2. Počáteční příprava analytického vzorku

Celý proces byl také zkoušen na systému 10539735 fy Whatman. Terčíky určené pro novorozenecký screening (filtrační papír s vyšším obsahem celulózy). Poněvadž se jedná o mnohem tenčí sací vrstvu může být doba vortexování oproti systému fy Capitainer zkrácena na dobu maximálně 3 hodin, doba 2 hodin již postačí.

Odběr a příprava analytického vzorku Whatman

3. UHPLC/HRMS

Systém Q EXACTIVE FOCUS (Thermo Fisher Scientific) v režimu plného skenu (full scan) Optimalizován v režimu Tune na MS7014 RECIPE® Optimisation Mix (parentní ionty: 395.325 - D₂, 383.331 - D₃).

UHPLC Ultima 3000, kolona LUNA® Omega, 1.6µm Polar C18, 50 x 2.1mm.

Výsledky

Ve vzorcích DBS u první skupiny 8 dobrovolníků stanoven D₃ v rozsahu hodnot 22.56 – 93.56 nmol/l bez přepočtu na hematokrit D₂ v těchto vzorkách detekován nebyl. Po optimalizaci doby třepání ad1. byla pro ověření na reálném vzorku DBS testována krev dobrovolnice s již podstatně vyšší hodnotou (62.57 nmol/l) a dále měřeny další DBS. Druhá skupina 7 dobrovolníků porovnány hodnoty v séru vs. DBS.

RECIPE ClinChek® - Serum Control, Level I (mean value 14,7-14.9 μg-L) a Venózní krev, muž, roč. 1993

Výsledky analýzy vzorků DBS u první skupiny 8 dobrovolníků

Porovnání hodnoty v séru vs. DBS skupiny 7 dobrovolníků

Diskuze a závěr

Za optimální hladiny vitamínu D₂/D₃ jsou četnými odborníky považovány hladiny v plasmě/séru kolem 100 nmol/l a vyšší. Avšak v evropské populaci včetně naší jsou nalézány hodnoty bohužel běžně nižší než 50 nmol/l.

Poznatky z prvé fáze vývoje metody byly úspěšně využity v nyní probíhající validační fázi, která zahrnovala přípravu 50 µl aliquotů rekonstituovaných kalibrátorů a kontrol hlubokým zmrazením na -70 °C a jejich postupné proměřování v DBS režimu Capitainer a Whatman Validace DBS kalibrací bez nutnosti stanovení konvergenčního faktoru (kapalné vzorky v. DBS/kapilární krev v. krev venózní) z prvé fáze vývoje metody bude nutným předpokladem použití metody v rutinním režimu monitorování DBS vzorků širší populace zejména v rámci.

Nevýhoda Whatman terčíků oproti Capitainer diskům - větší poloměr, nutnost celý terčík rozštípat speciálními štípacími kleštěmi na poměrně velký počet malých dílčích terčíků → prodloužení doby centrifugace a celkové doby zpracování vzorku před extrakcí. Nízké nálezy D₂ jdou evidentně na konto kvality nutrice dobrovolníků/pacientů (i když prozatím statisticky nevýznamný počet), viz přirozené zdroje D₂/D₃.