Adaptace metody RECIPE® 25-OH-VITAMIN D2/D3 in plasma and serum – ON LINE analysis pro vzorky suché krevní skvrny (DBS)

Cíl práce

Na platformě ověřené komerční metody fy RECIPE pro stanovení 25-hydroxy-vitaminů D₂/D₃ v plasmě či séru vyvinout robustní a spolehlivou metodu DBS, která je pro pacienta atraktivní s ohledem na korespondenční formu méně invazivního odběru vzorků.

Úvod

„Vitamín D“ zahrnuje skupinu steroidů, které hrají klíčovou roli v inkorporaci vápníku do kostní hmoty, v buněčné proliferaci, pozitivní vliv vyšších hladin ergokalciferolu (D₂) zejména cholekalciferolu (D₃) na úroveň humorální imunitní připravenosti organismu a modulaci jeho protizánětlivé odpovědi (v konotaci s vážnými průběhy COVID-19 – cytokinová bouře – velmi pozoruhodná role!). V prevenci i pozitivní vliv na DM I. i II. typu, homeostasis TK,…

Mimotělní zdroje vitaminu D₂:

• sušené houby (UV – na slunci)
• kvasinky (S. cerevisiae) – kvasnice (český chléb)

Mimotělní zdroje vitaminu D₃:

• Potraviny živočišného původu (ryby, zejména tresčí játra)
• Potraviny rostlinného původu – č. Solanaceae – zejména rajčata a brambory, obsah D₃ a 7-dehydrocholesterolu klesá ve směru: listy – plody – stonky - oddenky(hlízy)
• Obiloviny (zejména oves), tzv. fortifikovaná rostlinná mléka (ovesné, mandlové, kokosové)

Biologicky Aktivní formy jsou steroly: 25(OH)D2, 25(OH)D3 - biosynthesa v játrech 1α,25(OH)2D2/D3 – biosynthesa v ledvinách (KALCITRIOL) - přes 25(OH)D2/D3 (stimulace parathormonem – příštítná tělíska).

Dostatečná expozice slunečnímu světlu (UV-B) znamená rychlou biosynthesu (konverzi) D₂ na klíčový D₃. V zimním a časném jarním období klimatu mírného pásma je potom vhodná dieta bohatá na kalciferol nezbytná pro udržení dostatečné imunitní obranyschopnosti. Optimální denní dávka vitaminu D₃ ve věkovém rozpětí 1 – 70 let bez ohledu na pohlaví je 15 µg (Zákon č. 352/2009 Sb. ,DDD je od 25 let věku výše jen 5 µg). Aktivní metabolit 1,25-dihydroxycholekalciferol hraje důležitou regulační roli v produkci antimikrobiálních peptidů (např. katelicidinu). Kalcitriol je steroidní hormon přes parathormon (hydroxylace v tkáni ledvin) zajišťuje biologickou dostupnost vápníku pro jeho inkorporaci do kostní hmoty.

• VITAMIN D₂ – ERGOKALCIFEROL
• VITAMIN D₃ – CHOLEKALCIFEROL

Kalibrace

Kalibrováno na ClinCal® Calibrator RECIPE (0 – 197 nmol/l/D₃ , r² = 0.9964, 0 – 196 nmol/l/D₂, r² = 0.9954 kontrolováno pomocí ClinChek® - Control (serum, Level I s cílovou hodnotou 35.5 nmol/l, bias 11% pro D₂ , s cílovou hodnotou 37.1 nmol/l, bias 9.4% pro D₃ , Level II s cílovou hodnotou 103.0 nmol/l, bias 6.3% pro D₂ , s cílovou hodnotou 105.0 nmol/l, bias 4.6 % pro D₃ ).

Preanalytická fáze

Odběr vzorků DBS CAPITAINER (Sweden):

Kapka kapilární krve z prstu dobrovolníka byla aplikována na startovací pozici speciální odběrové soupravy fy Capitainer (Quantitative blood sampling card Capitainer B, The quantitative DBS system) zkoncentrována na produktový disk, který byl použit k vlastní analýze.

Analytická metodika

1. Počáteční příprava analytického vzorku:

K extrakci z disku DBS byl použit roztok RECIPE Precipitant P/IS (d6-25-OH-D₃, parent iont 389.368 m/z) o objemu 200µl vortex 90 minut, centrifugace 15000 ot/min po dobu 5 minut, 10 minut inkubace při 4°C, opět centrifugace při stejných podmínek jako v prvé a nástřik 50 µl výsledného supernatantu přímo na systém UHPLC/HRMS. Na základě studia výtěžnosti byl čas vortexování ustálen až na 6 hodinách, objem P/IS 400 µl, poté následovala již jen centrifugace za stejných podmínek bez inkubace.

2. Počáteční příprava analytického vzorku

Celý proces byl také zkoušen na systému 10539735 fy Whatman. Terčíky určené pro novorozenecký screening (filtrační papír s vyšším obsahem celulózy). Poněvadž se jedná o mnohem tenčí sací vrstvu může být doba vortexování oproti systému fy Capitainer zkrácena na dobu maximálně 3 hodin, doba 2 hodin již postačí.

3. UHPLC/HRMS

Systém Q EXACTIVE FOCUS (Thermo Fisher Scientific) v režimu plného skenu (full scan) Optimalizován v režimu Tune na MS7014 RECIPE® Optimisation Mix (parentní ionty: 395.325 - D₂, 383.331 - D₃).

UHPLC Ultima 3000, kolona LUNA® Omega, 1.6µm Polar C18, 50 x 2.1mm.

Výsledky

Ve vzorcích DBS u první skupiny 8 dobrovolníků stanoven D₃ v rozsahu hodnot 22.56 – 93.56 nmol/l bez přepočtu na hematokrit D₂ v těchto vzorkách detekován nebyl. Po optimalizaci doby třepání ad1. byla pro ověření na reálném vzorku DBS testována krev dobrovolnice s již podstatně vyšší hodnotou (62.57 nmol/l) a dále měřeny další DBS. Druhá skupina 7 dobrovolníků porovnány hodnoty v séru vs. DBS.

Diskuze a závěr

Za optimální hladiny vitamínu D₂/D₃ jsou četnými odborníky považovány hladiny v plasmě/séru kolem 100 nmol/l a vyšší. Avšak v evropské populaci včetně naší jsou nalézány hodnoty bohužel běžně nižší než 50 nmol/l.

Poznatky z prvé fáze vývoje metody byly úspěšně využity v nyní probíhající validační fázi, která zahrnovala přípravu 50 µl aliquotů rekonstituovaných kalibrátorů a kontrol hlubokým zmrazením na -70 °C a jejich postupné proměřování v DBS režimu Capitainer a Whatman Validace DBS kalibrací bez nutnosti stanovení konvergenčního faktoru (kapalné vzorky v. DBS/kapilární krev v. krev venózní) z prvé fáze vývoje metody bude nutným předpokladem použití metody v rutinním režimu monitorování DBS vzorků širší populace zejména v rámci.

Nevýhoda Whatman terčíků oproti Capitainer diskům - větší poloměr, nutnost celý terčík rozštípat speciálními štípacími kleštěmi na poměrně velký počet malých dílčích terčíků → prodloužení doby centrifugace a celkové doby zpracování vzorku před extrakcí. Nízké nálezy D₂ jdou evidentně na konto kvality nutrice dobrovolníků/pacientů (i když prozatím statisticky nevýznamný počet), viz přirozené zdroje D₂/D₃.