Nová éra hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie – donedávna doména úzce specializovaných laboratoří – se stala tahounem moderní analytické chemie. Od prvních otázek typu „je ve vzorku přítomen tento prvek?“ jsme se posunuli k fascinujícím možnostem sledovat, jak buňky vyrábějí proteiny, jaké mutace nese virová obálka nebo zda nové biologické léčivo skutečně vypadá tak, jak jsme ho navrhli. Dnešní přístroje už neukazují jen přítomnost látky, ale rozkrývají celé složité příběhy molekul – jejich stavbu, chování i interakce. A právě proto dnes stojíme na prahu nové éry – do laboratoří přichází přístroje, které měří rychleji, přesněji a citlivěji než kdykoli dřív.

Bioprocesy představují komplexní soustavu dějů, při nichž buňky produkují cílené molekuly – od jednoduchých metabolitů až po složité proteiny. Pro úspěšný vývoj bioléčiv je nutné tyto produkty detailně charakterizovat: ověřit, zda má virová obálka správnou strukturu, zda protein odpovídá požadované sekvenci a posttranslačním modifikacím, nebo zda ve vzorku nezůstaly nežádoucí nečistoty. Výzvou je i samotná heterogenita biologických systémů – dvě buňky stejného typu se mohou zásadně lišit v tom, jaké proteiny a v jakém množství produkují. Na tyto otázky už nestačí klasické analytické metody. Právě zde nachází hmotnostní spektrometrie své nezastupitelné místo – umožňuje s mimořádnou citlivostí a přesností určit nejen přítomnost látek, ale i jejich strukturu, kvantitu a vzájemné rozdíly. Díky tomu se stala klíčovým nástrojem biofarmacie i výzkumu, od kontroly vakcín až po „single-cell proteomics“, tedy detailní analýzu proteinového obsahu jednotlivých buněk.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Analytická chemie v bioprocesech

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Analytické výzvy v bioprocesech

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Analytické výzvy v bioprocesech - hmotnostní spektrometrie

Molekulární biologie a biofarmaceutický průmysl dnes stojí před nebývalými nároky na analytické technologie. V éře omics přístupů – genomiky, proteomiky, metabolomiky či lipidomiky – už nestačí analyzovat jeden protein nebo jedinou metabolickou dráhu. Je třeba zmapovat celé sítě molekul a pochopit jejich funkci v kontextu buněk, tkání i celého organismu. Takový úkol vyžaduje nástroje s mimořádným výkonem, a proto se hmotnostní spektrometrie stala klíčovým pilířem moderní bioanalýzy. Její další rozvoj je přitom tlačen šesti zásadními oblastmi: 

• separací, která musí zvládnout extrémně komplexní směsi
• ionizací, jež určuje, co se vůbec dostane do detektoru
• fragmentací, nezbytnou pro čtení molekulární struktury
• dynamickým rozsahem, který rozhoduje o tom, zda v záplavě dominantních signálů nezaniknou nízko zastoupené látky
• rychlostí, nutnou pro komplexní zmapování vzorku
• a rozlišením, které dovoluje odlišit i velmi blízké chemické entity.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Šest zásadních oblastí hmotnostní spektrometrie

Právě v proteomice se ukazuje, jak zásadní je posun v těchto parametrech. Zatímco identifikace proteinů je dnes rutinní, klíčovým úkolem je jejich kvantifikace napříč mnoha vzorky. K tomu se využívá metoda Tandem Mass Tag (TMT), při níž jsou peptidy označeny izobarickými značkami. Díky tomu je možné analyzovat více vzorků současně a přitom je od sebe spolehlivě odlišit v MS spektru. Nejnovější sada TMTpro 35-plex umožňuje sloučit až 35 biologických podmínek do jediné analýzy – což dramaticky zvyšuje statistickou sílu experimentů a šetří čas i náklady. Cena za tuto efektivitu je však vysoká: jednotlivé TMT kanály se liší o pouhé tisíciny jednotky m/z, takže bez velmi vysokého hmotnostního rozlišení by kvantifikace nebyla možná. Právě zde se ukazuje, proč jsou nové generace hmotnostních spektrometrů s rozlišením přesahujícím 100 000 FWHM nejen technologickými perlami, ale nutností pro seriózní proteomický výzkum.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - TMT - kvantitativní přístup v proteomice

Rozvoj hmotnostní spektrometrie lze v posledních letech sledovat zejména ve čtyřech instrumentálních kategoriích. (A) Kvadrupól + orbitální past (Orbitrap) – tato kombinace se stala zlatým standardem pro vysoce přesná měření, jak ukazuje úspěch řady Orbitrap Exploris. (B) Kvadrupól + lineární iontová past představuje flexibilní nástroj pro rutinní i pokročilejší aplikace, kde se cení robustnost a rychlost. (C) Kvadrupól + lineární iontová past + orbitální past (tzv. tribridy, např. Orbitrap Eclipse nebo Orbitrap Ascend) spojují výhody všech tří analyzátorů a nabízejí nejvyšší univerzálnost – od rychlého screeningu až po detailní strukturální studia. A konečně (D) Kvadrupól + orbitální past + TOF je kategorií, která přináší zcela nový rozměr. Díky dvěma vysokorozlišujícím analyzátorům – Orbitrapu a multireflexnímu time-of-flight (TOF) – lze dosáhnout paralelizace měření: Orbitrap poskytuje excelentní rozlišení a hmotnostní přesnost, zatímco TOF nabízí extrémní rychlost sběru dat. Tato kombinace otevírá cestu k experimentům, které by byly ještě před pár lety technicky nepředstavitelné – a právě sem směřuje vývoj nejnovějších přístrojů.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Rozvoj instrumentace hmotnostní spektrometrie

Do kategorie D patří zástupce nové generace: Orbitrap Astral. Tento přístroj spojuje kvadrupól s dvojicí vysokorozlišujících hmotnostních analyzátorů – Orbitrapem a TOF Astral analyzátorem (ASymmetric TRAck Lossless analyzer). Zatímco Orbitrap exceluje v rozlišení a přesnosti, Astral přidává extrémní rychlost akvizice, čímž vzniká kombinace ideální pro rozsáhlé proteomické experimenty. Standardní Astral zvládal akviziční rychlosti kolem 200 Hz, což samo o sobě znamenalo revoluci.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - The Orbitrap Astral instrumental family

Na tuto platformu nyní navazuje Orbitrap Astral Zoom, který dále posouvá hranice. Uvnitř přibyly klíčové inovace: 

• rychlejší iontový filtr a vysokorychlostní kvadrupól umožňující přepínat mezi izolačními okny s minimální ztrátou času; 
• Bent Trap pro pre-akumulaci iontů, který zvyšuje duty cycle a využití iontového balíčku až o 40 %; 
• vylepšený ion routing multipole, který dovoluje rychlejší stepped collision energy experimenty. 

Díky těmto úpravám se Zoom dostává na rychlost akvizice až 270 Hz – tedy o více než třetinu rychleji než původní Astral. Navíc nabízí nové režimy: 

• TMT High Resolution mode, který umožňuje spolehlivě kvantifikovat až 35 multiplexovaných vzorků, 
• low-input mode pro analýzu vzorků o velikosti jednotlivých buněk 
• rozšířený Enhanced Dynamic Range (eDR) mode.

Dohromady tak Orbitrap Astral Zoom nepředstavuje jen upgrade, ale spíše zcela novou třídu přístroje, kde se rychlost TOF analyzátoru a preciznost Orbitrapu propojují do jedné platformy – a to bez kompromisů na straně citlivosti nebo spolehlivosti.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Orbitrap Astral Zoom MS modifikace

Orbitrap Astral Zoom dnes představuje absolutní špičku hmotnostní spektrometrie a posouvá hranice moderní vědy, zatímco Orbitrap Excedion Pro staví na excelentní citlivosti a spolehlivosti kvadrupól-Orbitrap hybridů. Excedion vychází z platformy Exploris 480, dlouhodobě považované za robustní „workhorse“ proteomických laboratoří, avšak přidává řadu zásadních inovací. Tou nejviditelnější je Bent Trap pro pre-akumulaci iontů, která umožňuje téměř 100% duty cycle. Výsledkem jsou spektra s vyšším signal-to-noise poměrem i v rychlých MS2 akvizicích a možnost měření při 70 Hz.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro

Další klíčovou novinkou je Enhanced Dynamic Range (eDR), při němž se pořizují multiplexované MS1 subscany s rozdílnými časy akumulace. Tento přístup zajišťuje, že i nízkoabundantní ionty získají dostatečnou intenzitu signálu, a umožňuje tak sledovat složky vzorku napříč pěti řády koncentrace. Excedion navíc disponuje volitelným EASY-ETD zdrojem, který umožňuje elektron-transferovou fragmentaci. V kombinaci s HCD vzniká EThcD, poskytující bohatší fragmentační spektra a usnadňující mapování posttranslačních modifikací, například disulfidových můstků.

Vylepšení se dotkla i iontové optiky: nový Electrodynamic Ion Funnel (EDIF) zajišťuje šetrný přenos labilních molekul a minimalizuje nechtěnou fragmentaci už na vstupu. Přístroj je také připraven na Hybrid-DIA workflow, které v sobě kombinuje přesně cílené PRM s DIA, čímž propojuje svět „známého“ a „neznámého“ v jediné analýze. Speciální edice Excedion Pro BioPharma pak rozšiřuje hmotnostní rozsah až do m/z 12 000, což umožňuje detailní studium intaktních proteinů a vyšších řádů proteinových komplexů.

Ve srovnání s Explorisem 480 tak Excedion Pro nepředstavuje jen modernizovanou verzi, ale spíše novou generaci kvadrupól-Orbitrap hybridů – přístroj, který si zachovává kompaktní formát a uživatelskou přívětivost, avšak nabízí výrazně vyšší citlivost, flexibilitu a metodickou univerzálnost pro biofarmacii, proteomiku i metabolomiku.

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - Higher duty cycle for improved sensitivity

Pragolab: Nová éra hmotnostní spektrometrie - EASY-ETD on the Orbitrap Excedion Pro MS

Orbitrap Astral Zoom a Orbitrap Excedion Pro ukazují dvě tváře nové éry hmotnostní spektrometrie: přístroje překonávají hranice rychlosti a multiplexingu, posouvají citlivost a kvantitativní přesnost na úroveň, o které jsme ještě nedávno jen snili. Společně tak tvoří arzenál, který otevírá vědcům i biofarmaceutickému průmyslu možnosti, jaké tu ještě nebyly – od single-cell proteomiky až po detailní charakterizaci složitých proteinových léčiv.

Za touto technologií stojí Thermo Fisher Scientific, světový lídr v oboru, a v českém prostředí ji přináší společnost Pragolab s.r.o.. Ta dodává nejen špičkové přístroje, ale i jistotu, že věda se dá dělat efektivně, spolehlivě – a s trochou nadhledu, který je v laboratoři někdy stejně důležitý jako vysoké rozlišení.

Pro více informací nás neváhejte kontaktovat na:

• [email protected]
• [email protected]
• [email protected]