Česká chromatografická škola - HPLC.cz 2025 - Den 3

Úterní den zahájila přednáška společnosti Waters, která představila novou generaci svých HPLC systémů. Poté následovala odborná sekce zaměřená na analýzu léčiv a doplňků stravy, kterou uvedl Dalibor Šatínský alarmujícím pohledem na tristní kvalitu komerčních doplňků stravy v ČR. Na něj navázala Hedvika Moravcová kazuistikou k vývoji metody pro sledování nečistot v ivabradinu a Štefan Kosturko prezentoval význam plynové chromatografie pro analýzu esenciálních olejů a rostlinných drog. Sekci uzavřel Pavel Šištík prezentací vývoje multidimenzionální LC-MS/MS metody pro detekci inzulinových analog.

Po přestávce sponzorovanou firmou Phenomenex následovala sekce věnovaná kapilární elektroforéze. Václav Kašička nabídl komplexní přehled aplikací elektromigračních metod pro analýzu a charakterizaci proteinů a peptidů. Petr Tůma se věnoval propojení elektromembránové extrakce s CE pro detekci léčiv v moči a Jan Petr uzavřel dopolední blok praktickým využitím CE při charakterizaci nanoobjektů.

Odpoledne patřilo přednášce firmy Altium, která představila inteligentní řadu Agilent Infinity III LC. Následně se rozběhl oblíbený soutěžní workshop, kde si účastníci mohli zábavnou formou otestovat své znalosti v oblasti separačních metod pod vedením L. Novákové, O. Nováka a M. Douši.

Celý den byl zakončen společenským rautem s živou hudbou, který nabídl příležitost k neformálnímu setkání a výměně zkušeností mezi účastníky z akademického i aplikačního prostředí.

HPLCcz: Dotaznik spokojenosti Česká chromatografická škola - HPLC.cz 2025

Úterý 20. 05. 2025

09:00 – 09:10 Přednáška sponzora sekce: Waters – nová generace přichází

• Marek Exner (Waters)

HPLC.cz: Den 3 - Přednáška sponzora sekce - Waters – nová generace přichází (Marek Exner, Waters)

SEKCE 5: ANALÝZA LÉČIV A DOPLŇKŮ STRAVY (předseda M. Douša)

09:10 – 09:40 Tristní kvalita potravních doplňků na trhu v ČR

• Dalibor Šatínský

Doplňky stravy jsou koncentrované zdroje živin nebo jiných látek, které mají nutriční nebo fyziologický účinek a jejichž účelem je doplnit normální stravu kvůli předpokládaným přínosům pro zdraví [1]. Celosvětové prodeje potravinových doplňků zaznamenávají rychlý růst a zejména ty, které jsou založeny na rostlinných extraktech, patří k nejoblíbenějším, protože jsou považovány za bezpečnější a zdravější než syntetické látky. Panuje také předpoklad, že mají nižší nebo dokonce žádné vedlejší účinky. Tyto rostoucí tržby, které naznačují obrovskou popularitu doplňků stravy a obecný nedostatek odhodlání prosazovat účinnou legislativu (např. nedostatečná garance účinnosti a bezpečnosti) dělá trh s doplňky stravy zranitelnější vůči nečestným výrobcům. 

V EU jsou potravní doplňky regulovány stejně jako potraviny a současná legislativa je zaměřena pouze na vitamíny a minerály. Výrobci ve svých přípravcích deklarují obsah určitého množství např. rostlinného extraktu, ale tato informace neříká nic o obsahu bioaktivních látek. Složení a obsah bioaktivních látek v rostlinách se může lišit v závislosti na klimatu, teplotě, období, půdě a dalších faktorech. Rozpor mezi množstvím použitého extraktu a obsahem účinných látek v jedné dávce může mít podstatný vliv na dávkování a může vést k předávkování konzumenta nebo naopak k neúčinnému dávkování. Ačkoli je nezbytné zajistit bezpečí a neškodnost doplňků stravy, od jejich výrobců se nevyžadují žádná konkrétní posouzení. V EU bohužel zatím neexistují žádné kontroly výrobních standardů, které jsou přinejmenším podobné farmaceutické úrovni (GMP). V rámci příspěvku bude prezentován vývoj metod HPLC/UHPLC analýz a výsledky kontroly kvality obsahu vybraných potravních doplňků na bázi rostlinných extraktů s obsahem fenolických kyselin, anthokyanů, flavonoidů, fytosterolů, whitanolidů, berberinů, kurkuminů, gingerolů apod.

HPLC.cz: Den 3 - Tristní kvalita potravních doplňků na trhu v ČR (Dalibor Šatínský)

09:40 – 10:00 Pohádky tisíce a jedné nečistoty – případová studie ivabradinu

• Hedvika Moravcová

Over the past years, there has been growing interest among regulatory authorities in impurity control in newly registered drug substances and drug products. As a supportive material, the International Committee for Harmonization (ICH) has formulated a guideline that describes analytical procedures and impurity control criteria. According to this document, three types of impurities are defined: residual solvents, inorganic, and organic ones. [1] Organic impurities include starting material, by-products, intermediates, or degradation products and are mainly determined by chromatographic methods. Especially, liquid chromatography has become the method of choice in this field. Because of a need to determine various chemical moieties ideally within one sample run, the method development may be a challenging task. This is nicely represented by ivabradine and its related substances when many obstacles had to be overcome to ensure the method selectivity for ten different molecules.

HPLC.cz: Den 3 - Pohádky tisíce a jedné nečistoty – případová studie ivabradinu (Hedvika Moravcová)

10:00 – 10:20 Význam GC-MS při kontrole a charakterizaci lékopisných silic a těkavých složek rostlinných drog

• Štefan Kosturko

Silice představují komplexní směsi těkavých látek s významnými biologickými účinky a širokým uplatněním ve farmacii, potravinářství i kosmetickém průmyslu. Vzhledem k jejich rostoucí komerční hodnotě se zvyšuje i riziko falšování a kolísání jakosti surovin pro jejich výrobu. Cílem studie je představit analytický přístup ke kontrole silic, založený na kombinaci kvalitativní a kvantitativní analýzy pomocí plynové chromatografie s hmotnostní (GC-MS) a plamenoionizační detekcí (GC-FID). 

GC metoda byla aplikována na typické vzorky komerčně dostupných i experimentálně destilovaných silic máty peprné (Mentha × piperita L.) a fenyklu obecného (Foeniculum vulgare L.), přičemž byla zaměřena na kvalitativní i kvantitativní hodnocení sedmnácti těkavých sloučenin patřících do skupin monoterpenů a fenylpropanoidů. Mezi sledované látky patřily zejména menthol, menthofuran, pulegon, (E)-anetol, fenchon a estragol, z důvodu jejich terapeutického nebo toxického působení na lidský organismus. Chromatografická separace byla provedena na koloně HP-5MS (30 m × 250 μm × 0,25 μm) za použití teplotního gradientu s počáteční teplotou 60 °C a konečnou teplotou 140 °C, během 16 minut. 

Získané výsledky ukazují, že kombinace GC-MS a GC-FID představuje robustní nástroj pro rutinní kontrolu pravosti a jakosti silic, a zároveň umožňuje efektivní detekci potenciální kontaminace nebo falsifikátu. Prezentovaná metodika může sloužit jako základ pro standardizaci a validaci analytických postupů v oblasti kontroly přírodních produktů.

HPLC.cz: Den 3 - Význam GC-MS při kontrole a charakterizaci lékopisných silic a těkavých složek rostlinných drog (Štefan Kosturko)

10:20 – 10:40 Vývoj multidimenzionální LC-MS/MS metody pro separaci a citlivé stanovení inzulinu a jeho strukturních analogů

• Pavel Šištík

Inzulin a jeho strukturní analoga (lispro, aspart, glulisin, glargin, detemir a degludek) hrají významnou roli nejen v léčbě diabetu mellitu, ale také v soudním lékařství při objasňování případů nevyjasněných úmrtí způsobených předávkováním. Cílem této práce byl vývoj a optimalizace citlivé metody stanovení těchto látek v plazmě, především s důrazem na multidimenzionální kapalinovou chromatografii spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií (2D-UHPLC-MS/MS). 

Pro zajištění vysoké citlivosti a selektivity byly optimalizovány parametry hmotnostně-spektrometrické detekce (SRM přechody), a současně byly detailně zkoumány separační podmínky v 1D i 2D chromatografickém uspořádání. Byly testovány různé stacionární fáze (např. Cortecs C18+, Luna Omega C18, Kinetex C18) a složení mobilní fáze (kombinace vody, acetonitrilu, methanolu a kyseliny mravenčí), aby bylo dosaženo optimálního chromatografického rozlišení, zejména pro kritické páry inzulinů s velmi podobnou strukturou, jako je humánní inzulin a inzulin lispro. 

Byly provedeny také preanalytické experimenty zaměřené na minimalizaci adsorpce inzulinů na povrchy laboratorního skla a plastů. Dříve publikované experimenty stabilitních testů potvrdily, že zkumavky s K2EDTA jsou nejvhodnější volbou pro odběr a uchování vzorků krve z hlediska stability inzulinů při pokojové teplotě [1]. Pro validaci metody byla zvolena syntetická plazma BZ273, jejíž standardizované složení minimalizuje interferenci endogenního inzulinu a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků. 

Z hlediska stability byly testovány různé podmínky (krátkodobá, dlouhodobá a freeze-thaw stabilita) s a bez použití proteázového inhibitoru (PIC). Bylo zjištěno, že použití PIC nepřináší výrazné zlepšení stability inzulinů, a v některých případech dokonce snižuje citlivost metody. 

Nově vyvinutá metoda byla validována podle EMA kritérií pro validaci bioanalytických metod [2] a poskytuje dostatečnou citlivost (LLOQ 50 pg/mL) pro forenzní a klinické aplikace. Metoda již byla úspěšně implementována do rutinního provozu v Ústavu soudního lékařství Fakultní nemocnice Ostrava, kde významně přispívá k objasňování případů nevyjasněných úmrtí.

HPLC.cz: Den 3 - Vývoj multidimenzionální LC-MS-MS metody pro separaci a citlivé stanovení inzulinu a jeho strukturních analogů (Pavel Šištík)

10:40 - 11:10 Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

HPLC.cz: Den 3 - Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

11:10 – 11:20 Přednáška sponzora sekce: Symbióza povrchově porézních částic a plně porézních částic: Správné použití pro lepší výsledky HPLC a UHPLC

• Jan Vlasák (Phenomenex)

HPLC.cz: Den 3 - Přednáška sponzora sekce - Symbióza povrchově porézních částic a plně porézních částic - Správné použití pro lepší výsledky HPLC a UHPLC (Jan Vlasák, Phenomenex)

SEKCE 6: KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA (předseda P. Bednář)

11:20 – 11:50 Analýza a fyzikálně chemická charakterizace peptidů a bílkovin kapilárními elektromigračními metodami

• Václav Kašička 

Capillary zone electrophoresis (CZE) and capillary isotachophoresis (CITP) will be presented as high-performance separation methods with a wide applicability for analysis and physicochemical characterization of peptides and proteins [1, 2]. Purity degree of synthetic peptides, e.g. prolactin-releasing peptide, cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide, and ghrelin, and their lipidized analogs with covalently attached fatty acids (octanoic, palmitic and myristic) was determined by CZE with UV-absorption detection in acidic background electrolytes (BGEs) composed of formic and acetic acids. Microheterogeneity of proteins (monoclonal antibodies) was evaluated by CZE with ESI-MS detection using the same BGEs. The content of anionic counterions (fluorides, acetates, trifluoroacetates) in basic peptides was estimated by CITP. 

Acid-base and electromigration properties of the above (lipo)peptides were investigated by combination of CZE and CITP. Acidity constants (pKa) of ionogenic groups of (lipo)peptides and actual ionic mobilities of their ionic forms were obtained by nonlinear regression analysis of pH dependence of their effective mobilities measured by CZE in BGEs within a wide pH range (2.0–12.0). From this dependence, also the isoelectric point (pI) of (lipo)peptides was estimated. The effective charge of these (lipo)peptides was determined from their cationic CITP analysis. The method is based on a linear relationship between the length of the ITP zone of the analyte and its effective charge and the injected substance amount [3]. 

HPLC.cz: Den 3 - Analýza a fyzikálně chemická charakterizace peptidů a bílkovin kapilárními elektromigračními metodami (Václav Kašička)

11:50 – 12:20 On-line spojení elektromembránové extrakce s kapilární elektroforézou pro stanovení léčiv v lidské moči

• Petr Tůma

Elektromembránová extrakce (EME) představuje selektivní techniku pro úpravu klinických vzorků, kterou lze provádět v mikroměřítku s minimální spotřebou klinického materiálu a ostatních činidel [1]. V přednášce budou představeny konstrukce miniaturních EME sond [2, 3] a možnosti jejich on-line kombinace s kapilární elektroforézou [4]. Diskutovány budou zejména otázky zaměřené na spojení EME s kapilární elektroforézou prostřednictvím různých verzí flow gating interface [5], elektroforetická separace v krátkých kapilárách [6] v kombinaci s bezkontaktní vodivostní detekcí [7], využití 3D tisku pro konstrukci mikrofluidních zařízení a automatizace celého analytického procesu. Aplikační část se bude věnovat stanovení bazických aminokyselin [2], anestetika ketaminu [8] a syntetického opioidu metadonu [3] v lidské moči.

HPLC.cz: Den 3 - On-line spojení elektromembránové extrakce s kapilární elektroforézou pro stanovení léčiv v lidské moči (Petr Tůma)

12:20 – 12:40 Charakterizace nanoobjektů kapilární elektroforézou

• Jan Petr 

Kapilární elektroforéza (CE) představuje vysoce účinnou separační techniku, která našla své uplatnění i v oblasti charakterizace nanoobjektů. Nanoobjekty mají typicky velikost mezi 1 a 100 nm, někdy např. v případě nanotrubiček i do 500 nm v jedné dimenzi. Vlastnosti těchto útvarů (nanočástic, 2D materiálů, nanotrubiček) jsou silně závislé právě na velikosti a výrazně se liší od vlastností makroskopických materiálů. 

V rámci tomto příspěvku bude zmíněn teoretický úvod do elektroforézy nanoobjektů – zejména pohled na strukturu, náboj a velikost nanomateriálů, dále teoretický popis elektromigrace a vlastní příklady aplikovatelnosti CE v analýze nanoobjektů. Budou zmíněny možnosti kontroly kvality syntézy nanočástic [1] a využití Taylorovi disperzní analýzy (TDA) ve spojení s hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) pro určení velikosti nanoobjektů ve směsích [2]. Jako poslední pak bude diskutována možnost použití elektroforetického separačního kroku před TDA-ICP-MS analýzou pro přesné určování velikostí a koncentrací nanočástic v prostředí svých vlastních iontů. 

Autoři děkuji za podporu výzkumu Grantové agentuře ČR (projekt 25-17563S).

HPLC.cz: Den 3 - Charakterizace nanoobjektů kapilární elektroforézou (Jan Petr)

12:40 - 14:15 Oběd

14:15 – 14:25 Přednáška sponzora workshopu: Nechte se okouzlit novou generací LC Infinity III – je SMART a s ní budete i VY

• Jan Kovář (Altium)

HPLC.cz: Den 3 - Přednáška sponzora workshopu - Nechte se okouzlit novou generací LC Infinity III – je SMART a s ní budete i VY (Jan Kovář, Altium)

SEKCE 7: SOUTĚŽNÍ WORKSHOP

14:25 – 17:30 ANEB, OTESTUJTE SI VAŠE VĚDOMOSTI V OBLASTI SEPARAČNÍCH METOD

• Lucie Nováková, Ondřej Novák, Michal Douša

HPLC.cz: Den 3 - SOUTĚŽNÍ WORKSHOP - ANEB, OTESTUJTE SI VAŠE VĚDOMOSTI V OBLASTI SEPARAČNÍCH METOD

HPLC.cz: Den 3 - Vítězný tým soutěžního workshopu - ANEB, OTESTUJTE SI VAŠE VĚDOMOSTI V OBLASTI SEPARAČNÍCH METOD

19:00 Raut s živou hudbou

Partneři a sponzoři konference

HPLCcz: Partneři a sponzoři konference - Waters

HPLC.cz: Partneři a sponzoři konference - Phenomenex