Stanovení volných plazmatických metanefrinů pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí

Diferenciální diagnostika neuroendokrinních tumorů

Plazmatické metanefriny, metanefrin a normetanefrin, jsou 3-O-methylované metabolity katecholaminů, které zaujímají důležité místo v diferenciální diagnostice neuroendokrinních onemocnění. Neuroendokrinní nádory představují různorodou skupinu onemocnění s různou klinickou symptomatologií a etiopatogenezí a jejich včasná diagnostika je zcela zásadní pro léčbu a chirurgickou intervenci. Postup při diagnóze neuroendokrinních nádorů je založen na několika aspektech - na klinické symptomatologii, na laboratorní diagnostice a na zobrazovacích technikách.

Neuroendokrinní nádory, které pocházejí z chromafinní tkáně sympatického nebo parasympatického nervového systému, jako jsou feochromocytom nebo paragangliom, vykazují setrvalou nebo paroxyzmální nadměrnou produkci katecholaminů. Laboratorní průkaz nadprodukce katecholaminů tumorem je limitován řadou faktorů jako např. nespecifické zvýšení hodnot v důsledku sekundárního stresování při odběru, nedodržením dietního opatření či zkreslením výsledků přítomností němých feochromocytomů.

Důležitým aspektem pro laboratorní diagnostiku je plynulá a nezávislá produkce metanefrinů nádorovými buňkami. Metanefrin a normetanefrin jsou preferovány pro diferenciální diagnostiku feochromocytomu vzhledem k jejich vysoké diagnostické senzitivitě a specificitě.

V laboratorní diagnostice je pro stanovení volných plazmatických metanefrinů využíváno několik metod. Často se používají metody klasické kapalinové chromatografie s následnou spektrofotometrickou, fluorimetrickou či elektrochemickou detekcí. Tyto metody však vyžadují poměrně náročnou přípravu vzorku a delší chromatografii pro separaci interferujících látek. U metod využívajících plynovou chromatografi i je zase nutná derivatizace analytů pro převedení na jejich těkavou formu. Imunoanalytické metody pro stanovení
plazmatických metanefrinů jsou sice jednoduché a rychlé, ovšem jejich výsledky mohou být ovlivněny křížovými reakcemi s dalšími látkami.

Co nás vedlo k vyvinutí LC-MS/MS metody pro stanovení volných metanefrinů v plazmě?

V diagnostické laboratoři Spadia a.s. jsme využívali pro kvantitativní stanovení plazmatických metanefrinů IVD kit (in vitro diagnostický kit) na principu ELISA. Později se na trhu objevil IVD kit určený pro HPLC systémy s coulometrickou detekcí, který však vyžadoval poměrně složitou implementaci do rutinního provozu. Proto jsme se rozhodli porovnat ELISA a HPLC metodiky pro stanovení plazmatických metanefrinů pro potřeby privátní laboratoře. Testování odhalilo významné rozdíly v kvantitativních výsledcích obou metod (viz Obrázek 1).

Toto zjištění nás vedlo k rozhodnutí zavést metodu založenou na chromatografickém přístupu. Omezením klasické HPLC metody je ovšem náročná příprava vzorků a dlouhý čas analýzy. Příprava série vzorků pro stanovení HPLC trvá okolo 2 hodin, vyžaduje krok extrakce na tuhou fázi (SPE), odpařování elučního činidla a i samotná analýza je časově velmi náročná (doba analýzy jednoho vzorku trvá okolo 50 minut). Nabízelo se však využití LC-MS/MS techniky, která díky vysoké selektivitě a citlivosti umožňuje přípravu vzorku značně zjednodušit a dobu analýzy výrazně zkrátit.

Cílem této práce byl vývoj a implementace rutinní metody stanovení volných metanefrinů v plazmě, která by eliminovala nevýhody klasických chromatografických technik i dříve využívané ELISA metody.

SPADIA LAB: Obrázek 1 - Grafické znázornění koncentrací normetanefrinu (graf vlevo) a metanefrinu (graf vpravo) v plazmě stanovených pomocí IVD kitu pro HPLC s elektrochememickou detekcí a IVD kitu využívajícího ELISA (n = 11)

SPADIA LAB: Obrázek 2 - Grafické znázornění koncentrací normetanefrinu (graf vlevo) a metanefrinu (graf vpravo) v plazmě stanovených pomocí IVD kitu pro HPLC s elektrochememickou detekcí a vyvinuté LC-MS/MS metody (n = 24)

Vývoj a implementace LC-MS/MS metody pro stanovení volných metanefrinů v plazmě

Příprava vzorků

Vyšetření se provádí ze vzorku plazmy odebrané do odběrové soupravy s antikoagulačním činidlem EDTA. Po odběru je nutné krev centrifugovat 10 min při 4000 g a získanou plazmu do okamžiku provedení analýzy uchovávat při -20 °C.

Příprava vzorku k analýze je nenáročná a nevyžaduje extrakci na pevné fázi (SPE). Ke vzorku jsou přidány deuterované standardy obou analytů, poté je provedena precipitace proteinů isopropanolem, odpaření pod proudem dusíku a rekonstituce ve 100 μl mobilní fáze.

SPADIA LAB: Vývoj a implementace LC-MS/MS metody pro stanovení volných metanefrinů v plazmě

LC-MS/MS metoda

Separace plazmatických metanefrinů probíhá na UHPLC systému Agilent 1290 Infinity, na koloně SeQuant®ZIC®HILIC HPLC 3,5 μm; 100 × 2,1 mm (Merck, Německo) a analyty jsou separovány gradientovou elucí mobilních fází skládající se z 50 mM vodného roztoku mravenčanu amonného a acetonitrilu při průtoku 0,3 ml/min a teplotě 45 °C. Analyty jsou detekovány na hmotnostním spektrometru Agilent 6490 Triple Quadrupole (parametry iontového zdroje a MRM přechody jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2). Celková doba analýzy je 6 min a retenční časy separovaných analytů jsou 2,4 min pro MN a 2,6 min pro NMN (Obrázek 3a, 3b).

Tabulka 1: Parametry LC-MS/MS iontového zdroje

• Agilent Jet Stream ESI: pozitivní mód
• Teplota sušícího plynu: 135 °C
• Průtok sušícího plynu: 12 l/min
• Nebulizer: 45 psi
• Teplota fokusačního plynu: 400 °C
• Průtok fokusačního plynu: 10 l/min
• Napětí ESI: 4000 V
• Napětí trysky (Nozzle): 0 V

SPADIA LAB: Tabulka 2 - Tabulka MRM přechodů

SPADIA LAB: Obrázek 3a - Stanovení volných metanefrinů v plazmě pomocí LC-MS/MS metody, chromatogram kontrolního vzorku

SPADIA LAB: Obrázek 3b - Stanovení volných metanefrinů v plazmě pomocí LC-MS/MS metody, chromatogram pacientského vzorku

Porovnání vyvinuté LC-MS/MS metody s kitem pro HPLC

Vyvinutá metoda byla testována na pacientských vzorcích a data byla porovnána s daty získanými z kitu pro HPLC. Z Obrázku 2 je patrné, že LC-MS/MS metoda poskytovala obdobné výsledky jako HPLC metoda s coulometrickou detekcí. Z pohledu náročnosti na přípravu vzorků a délky chromatografické separace však představuje LC-MS/MS metoda významnou úsporu času a nákladů na analýzu.

Rozsah kalibrace vyvinuté metody pro metanefrin je 0,035 – 7,175 nmol/l (Obrázek 4) s limitem kvantifikace 0,035 nmol/l (CV = 4,8 %) a rozsah kalibrace pro normetanefrin je 0,049 – 9,956 nmol/l (Obrázek 5) s limitem kvantifikace 0,049 nmol/l (CV = 6,7 %). Výtěžnost, určená metodou standardního přídavku se pohybovala v rozmezí 89 – 98 %. Variační koeficienty (CV) preciznosti v sérii a mezilehlé preciznosti se pohybovaly pod 10 % (viz Tabulka 3).

Pro určení mezilehlé preciznosti byly použity dvě hladiny kontrolních materiálů ClinChek® for Metanephrines.

SPADIA LAB: Tabulka 3 - Preciznost v sérii a mezilehlá preciznost

Závěrem

Prezentovaná LC-MS/MS metoda poskytuje vyhovující analytické parametry pro oba analyty. Srovnání výsledků s HPLC metodou potvrdilo vhodnost použití tohoto postupu pro stanovení volných metanefrinů v plazmě v rutinní diagnostické laboratoři. Zavedením LC-MS/MS metody do rutinního provozu laboratoře byla významně zjednodušena příprava vzorku a zkrácen čas analýzy z 50 min na 6 min.

SPADIA LAB: Obrázek 4 - Kalibrační křivka pro metanefrin v plazmě

SPADIA LAB: Obrázek 5 - Kalibrační křivka pro normetanefrin v plazmě