Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF

Kapalinová chromatografie ve spojení s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií se stala hlavní technikou v aplikacích, kde je potřeba analyzovat velké množství látek v komplexních vzorcích. I přes rychlý vývoj v kapalinové chromatografii a hmotnostní spektrometrii však zůstává velký prostor pro zlepšení separace látek.

Právě pro nejnáročnější aplikace je určen nový Agilent 6560 Ion Mobility QTOF, který do LC/MS přináší třetí separační rozměr: iontovou mobilitu v homogenním elektrickém poli (uniform field ion mobility). Lze tak významně zvýšit píkovou kapacitu a získat více informací o všech látkách během jedné analýzy. V iontové mobilitě v homogenním elektrickém poli se ionty dělí ředevším podle tvaru, velikosti a náboje, takže lze separovat látky, které mají stejné m/z, ale odlišnou strukturu nebo konformaci. Při vývoji Agilent 6560 Ion Mobility QTOF byl důraz kladen na možnost přímého určení efektivního srážkového průřezu iontů (collisional cross section, Ω) bez nutnosti kalibrace, a dále na kritické parametry jako je rozlišovací schopnost iontové mobility, citlivost a zachování nativní struktury analytů.

Konstrukce 6560 Ion Mobility QTOF

Agilent 6560 Ion Mobility QTOF vychází z nejvyššího QTOF systému Agilent 6550 QTOF, který využívá technologii duálních iontových nálevek iFunnel pro dosažení vysoké citlivosti. Právě do oblasti iFunnel byla integrována mobilitní část, skládající se z několika prvků (obr. 1). Ionizované látky jsou nejprve fokusovány v první iontové nálevce (front funnel), odkud pokračují k druhé části optiky sloužící pro zachycení a skladování iontů (trapping funnel). Odtud balíčky iontů přecházejí do 80 cm dlouhé driftovací trubice (drift tube) obsahující jako driftovací plyn dusík. Protože při separaci dochází k rozostření paprsku iontů, je driftovací trubice ukončena další iontovou nálevkou (rear funnel) pro jejich opětovnou fokusaci.

Altium: Obrázek 1: Schéma Agilent 6560 Ion Mobility QTOF.

Rozlišovací schopnost iontové mobility

Rozlišovací schopnost iontové mobility je definována podobně jako v případě hmotnostníspektrometrie, ale místo m/z se v tomto případě pracuje s driftovacím časem:

Altium: Rozlišovací schopnost iontové mobility je definována podobně jako v případě hmotnostníspektrometrie, ale místo m/z se v tomto případě pracuje s driftovacím časem.

Hlavním parametrem limitujícím rozlišovací schopnost je rozšiřování zón způsobené difúzí. Difúze souvisí s délkou driftovací cely (L), intenzitou elektrického pole (E), nábojem analytu (Q) a teplotou driftovacího plynu (T). Dalším parametrem ovlivňujícím rozlišovací schopnosti iontové mobility je šířka balíčku iontů vstupujících do driftovací trubice. Díky unikátní konstrukci optiky pro záchyt a skladování iontů (trapping funnel) je dosaženo velmi úzkých a jasně definovaných balíčků [1]. Agilent 6560 Ion Mobility QTOF tak běžně dosahuje rozlišovací schopnost více než 60 pro malé i velké molekuly. Přístroj tak například umožňuje separovat α a β glukózy, které se liší pouze polohou jediné hydroxylové skupiny (obr. 2).

Altium: Obrázek 2: Separace α a β glukózy v iontové mobilitě na přístroji Agilent 6560 IM-QTOF.

Citlivost

Revoluční konstrukce „trapping funnel“ je však klíčová i z hlediska dosažení vysoké citlivosti přístroje. Různé experimentální typy mobilitních analyzátorů využívajících homogenní elektrické pole existují již řadu let, nicméně tyto přístroje vždy trpěly vysokou ztrátou iontů (> 99,9 %). K nejvyšším ztrátám docházelo především v oblasti záchytu iontů, avšak iontová past na bázi elektrodynamických nálevek představuje velmi efektivní techniku pro záchyt a skladování iontů při vyšších tlacích (cca 4 torr) [2]. Dalším prvkem zvyšujícím citlivost je iontová nálevka na konci driftovací trubice, která zajišťuje dodatečnou fokusaci separovaných iontů. Finální konstrukce tak vykazuje více než tisícinásobné zvýšení přenosu iontů.

Přímé měření Ω – „collision cross section“

Unikátní vlastností Agilent 6560 Ion Mobility QTOF, která vyplývá z využití iontové mobility v homogenním elektrickém poli, je schopnost přímého určení efektivního srážkového průřezu iontů (collision cross section, Ω) [3]. Efektivní srážkový průřez iontů popisuje průměrnou plochu, která je vystavena pružným srážkám s driftovacím plynem. Na rozdíl od driftovacího času, který závisí na typu přístroje a proměnných jako je teplota a tlak driftovacího plynu, Ω představuje konstantní hodnotu související s daným iontem a typem driftovacího plynu (obvykle He nebo N2). MassHunter software obsahuje funkci, která maximálně zjednodušuje výpočet Ω pro prakticky kterýkoli ion z naměřených dat. Správnost určení Ω je s maximální chybou do 2 %, ale obvykle je dosahováno odchylky pod 1 %. Ostatní komerčně dostupné mobilitní analyzátory, založené na jiných principech pro výpočet efektivního srážkového průřezu, potřebují nejen kalibraci na látky se známým Ω, ale tyto kalibrační látky musí být i strukturně podobné [4].

Zachování nativní struktury látek

Zcela nezbytné pro měření Ω je zachování nativní struktury (konformace) látek. Avšak při používání iontové optiky s RF napětím je iontům předána energie, což se projeví jako zvýšená efektivní vibrační teplota (odtud obvyklý název tohoto jevu: „ion heating“). Pokud je dodaná energie příliš vysoká, může se projevit změnou konformace nebo fragmentací analytů [5, 6]. Výhodou iontové mobility v homogenním elektrickém poli je, že pracuje pouze se stejnosměrným napětím v driftovací trubici. Pro minimalizaci tohoto jevu lze optimalizovat RF napětí ve všech částech iontové optiky. Na obrázku 3 je jasně dokumentován vliv RF napětí v trapping funnel na konformaci ubiquitinu.

Altium: Obrázek 3: Vliv RF napětí v trapping funnel na Ubiquitin [M+7H]⁷⁺. Nativní forma obsahuje dva izomery, avšak zvýšením RF vzniká řada.

Agilent 6560 Ion Mobility QTOF je první komerčně dostupný LC/MS přístroj využívající novou generaci iontové mobility v homogenním elektrickém poli. Díky revolučnímu návrhu iontové optiky využívající elektrodynamické iontové nálevky řeší všechny neduhy této mobilitní techniky a zachovává její hlavní výhody, jako je přímý výpočet Ω a minimální vliv na změny nativní struktury iontů. Výsledkem je nástroj pro ty nejnáročnější aplikace.

Altium: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF.