Měření čistoty malých objemů DNA při 4 °C s použitím Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometru s optickým vláknem s mikrosondou

Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr je ideálním přístrojem pro měření malých objemů biologických vzorků přímo z jejich skladovacího prostředí – například lednice. Tato studie ukazuje, jak je možné využít Cary 60 pro měření čistoty DNA při 4 °C s použitím příslušenství optického vlákna s mikrosondou. Výsledkem tak jsou značné úspory času i nákladů bez kompromisů v přesnosti a opakovatelnosti kvality dat.

• Už není třeba kyvet.
• Měření vzorků přímo z lednice při 4 °C.
• Úspora času a peněz za analýzu.

Měření čistoty a koncentrace DNA pomocí UV-Vis spektrofotometrie je cenným nástrojem v poli biotechnologie již mnoho let, od doby kdy byla metodika původně vyvinuta Warburgem a Christianem v roce 1942 a později byla optimalizována pro jednoduchá a rychlá laboratorní měření Sambrookem v roce 1989. Klíčové výhody spektrofotometrického přístupu spočívají především v tom, že měření jsou

1. jednoduchá
2. přesná
3. nedestruktivní vůči vzorku.

Je možno tak ušetřit čas, aniž by bylo třeba kompromisu v generované kvalitě dat, stejně tak to přináší finanční výhodu, jelikož není třeba používat velké objemy vzorku nebo další spotřební materiál nutný k měření.

V předkládané studii jsme se zaměřili na nový Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr s využitím optického vlákna pro měření malých objemů při 4 °C za podmínek normálního laboratorního osvětlení. Tento přístup dovoluje uživatelům dostat přístroj ke vzorkům, a nikoli jako v konvenčním spektroskopickém přístupu kdy vzorek je nutné přinést k přístroji, ve výsledku tak může uživatel provádět jejich analýzu ve zlomku času.

Unikátní optické uspořádání Cary 60 toto umožňuje především díky jedinečné vysoce intenzivní xenonové zábleskové lampě v kombinaci s nejnovější elektronikou. Systém tak umožňuje efektivně zaznamenávat malé změny v absorbanci bez ovlivnění okolním světlem. Hlavní výhody toho přístupu jsou diskutovány dále v tomto článku.

Přístroje a materiály

• Cary 60 UV-Vis se softwarem WinUV a PC
• Optické vlákno s mikrosondou
• „Coupler“ pro optické vlákno
• Křemenné kyvety
• DNA z telecího brzlíku

Metody a výsledky

Roztoky různé koncentrace DNA (z telecího brzlíku) v rozsahu od 0 do 50 µg/ml byly připraveny rozpuštěním v MiliQ vodě. Přístroj Cary 60 byl vybaven „couplerem“ pro optické vlákno s mikrosondou, jak je vidět na Obrázku 1.

Jako blankové vzorky byla použita 150 µl ultra čisté vody v mikrozkumavkách. Jelikož reagenciev molekulární biologii jsou běžně skladovány v lednici, všechny vzorky tedy byly analyzovány ihned po vyjmutí z lednice. Nejdříve bylo provedeno skenování od 340 do 240 nm s použitím dedikovaného modulu „RNA-DNA estimation“ v rámci softwaru Cary WinUV, aby bylo potvrzeno absorpční maximum komerčního vzorku DNA (Obrázek 2).

Altium International: Obrázek 1 Přístroj Cary 60 vybaven optickým vláknem při měření 150 µl DNA v mikrozkumavce; Obrázek 2 Skeny 150 µl vzorku DNA při teplotě 4 °C pro dvě koncentrace ukazující charakteristické absorbanční píky při 260 nm

Aby byla potvrzena čistota DNA, bylo provedeno měření poměru 260/280 pomocí SW dedikovaného modulu „RNA-DNA estimation“ v softwaru Cary WinUV, který automaticky počítá čistotu vzorku DNA a také odečítá pozadí při 320 nm. Tato aplikace je extrémně jednoduchá na použití, jak dokazuje Obrázek 3, a analýzy byly změřeny za méně než minutu. Nakonec byla koncentrační křivka vynesena do grafu, aby byla posouzena linearita a reprodukovatelnost měření různých koncentrací vzorků DNA za stejných laboratorních podmínek (Obrázek 4).

Altium International: Obrázek 3 Jednoduchý, dedikovaný WinUV automaticky vypočítá čistotu, autenticitu a koncentraci DNA; Obrázek 4 Koncentrační křivka DNA vzorků (0 – 50 µl/ml) s použitím 150 µl vzorku při teplotě 4 °C v mikrozkumavkách měřených za podmínek normálního laboratorníhoosvětlení s pomocí optického vlákna s mikrosondou

Mikrosonda byla vždy mezi měřením jednotlivých vzorků promyta ultračistou vodou. Pro proměření pěti vzorků bylo třeba méně než dvou minut. Při běžné metodě s použitím mikrokyvety, která by vyžadovala čas než by se vzorek ohřál na laboratorní teplotu a čas na čištění kyvety během měření. Celkově vzato, čas analýzy s použitím Cary 60 s optickým vláknem je významně redukován o odhadovaných 80 %. Kromě toho technika optického vlákna není náchylná k potenciální kontaminaci v důsledku manipulace se vzorkem. Přesnost v datech, spolu s výrazným ušetřením času při měření chladných vzorků pomocí mikrosondy ukazuje, že Cary 60 představuje jednoduchý a rychlý a cenově výhodný systém pro měření biologických vzorků, jako je DNA. Tento přístup může být snadno a přímo rozšířen i na další typy vzorků jako je například měření proteinů měření 280 nm.

Altium: Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr vybaven optickým vláknem

Závěr

Cary 60 UV-Vis je ideálním přístrojem pro spojení s optickým vláknem, vzhledem k unikátní vysoce intenzivní zábleskové xenonové lampě, která poskytuje vynikající citlivost a opakovatelnost. Rychlost analýz, opakovatelnost výsledků a snadnost použití pro měření vzorků DNA – tyto výhody jsou demonstrovány touto studií. Dalšími klíčovými výhodami používání Cary 60 s optickým vláknem pro analýzu biologických vzorků jsou:

• Horké i chladné vzorky (4-110 °C) mohou být bez obav analyzovány, naopak při měření v kyvetách mohou tyto podmínky vést k nesprávným a nereprodukovatelným výsledkům.

• Bez limitu na objem vzorku – lze měřit vzorky od objemu 40 µl až do neomezeně většího objemu.

• Není třeba kupovat drahé křemenné kyvety nebo pak ztrácet čas jejich čištěním.

• Pevné látky, práškové nebo gelové formy vzorků je možno změřit pomocí unikátní reflektanční sondy

Výběr nejnovějších aplikací Agilent pro UV-Vis v knihovně LabRulez

• Optical Characterization of Materials Using Spectroscopy (Příručky | 2023)

• Modular UV-Vis Spectroscopy: A Ground-breaking Approach to Diverse Application Needs (Technické články | 2024)

• Agilent Cary 3500 Flexible UV-Vis Spectrometer: Benefits of a Wide Dynamic Range (Technické články | 2023)

• Cary UV Workstation Software (Ostatní | 2023)

• SPADNS Colorimetric Method to Quantify Fluorides in Water (Aplikace | 2023)

• SPANDS Colorimetric Method to Quantify Fluorides in Water (Aplikace| 2023)

• High Temperature Dehydration Studies Using UV-Vis-NIR Diffuse Reflectance Spectroscopy (Aplikace | 2023)

• Characterizing Sub-Nanometer Narrow Bandpass Filters Using an Agilent Cary UV-Vis-NIR (Aplikace | 2023)

• Evaluation of the Cary Absolute Specular Reflectance Accessory for the Measurement of Optical Constants of Thin Films (Aplikace | 2023)

• Spectral Transmission Requirements for Plastic Pharmaceutical Packaging in Accordance with USP (Aplikace | 2023)

• Measurement of Diffuse Reflection from Catalyst Powders (Aplikace | 2023)

• Measuring the Optical Properties of Photovoltaic Cells (Aplikace | 2023)