UV-VIS spektrofotometr Agilent Cary 3500 a jeho přínos pro analýzu proteinů

Měření pomocí UV-Vis spektrofotometru umožňuje rychlou a spolehlivou kontrolu vzorků. Spektrofotometr lze využít i pro výpočet specifické aktivity nebo odhadu výtěžku purifikace a také k identifikaci frakcí obsahujících proteiny nebo aminokyseliny.

Proteiny obsahující aminokyseliny s aromatickými postranními řetězci absorbují záření při zhruba 280 nm, proto můžeme provést kvantitativní stanovení pomocí UV-Vis spektrofotometru. Koncentraci stanovíme díky znalosti Lambert-Beerova zákona a znalosti absorpčního koeficientu. V případě proteinů máme velmi často omezené množství vzorku, a proto je důležité, aby bylo možné vzorek analyzovat pouze z malého objemu. Proskenování vzorku může poskytnout informace o potenciálních kontaminantech. Cary 3500 muticell má držák kyvet, který je integrovaný a trvale zafixovaný tak, aby při měření v kyvetách s ultra malým objemem bylo dosahováno spolehlivých a opakovatelných výsledků.

HPST: Obr. 1: Cary 3500 muticell má držák kyvet

Cary 3500 má vysoce kolimovaný paprsek, který je široký méně než 1,5 mm. Malá velikost paprsku činí z tohoto spektrofotometru ideální nástroj pro měření v kyvetách s malou aperturou, jako je například ta na tomto obrázku.

Tato studie demonstruje výhody spektrofotometru Cary 3500 pro kvalitativní a kvantitativní analýzu malých objemů proteinů. V experimentu byl použit sérový hovězí albumin (BSA), který se běžné používá jako proteinový standard se známým absorpčním koeficientem.

Experimentální část

Vzorky

0,01 M roztok fosfátového pufru (PBS) byl připraven s pH 7. Byl připraven zásobní roztok BSA o koncentraci 10 mg/ml a poté byl naředěn na koncentrace 0,75; 1,5; 2,25; 3 a 3,75 mg/ml. Pro měření připravených vzorků bylo použito šest kyvet s objemem 70 µl, s aperturou 2 x 2,2 mm a s optickou drahou 10 mm. Jedna kyveta byla použita pro referenci a pět kyvet na vzorky. Standardní 3,5 ml kyveta s optickou drahou 10 mm byla použita pro měření opakovatelnosti. PBS pufr byl použit jako reference.

Přístroj a metoda

Pro všechna měření byl použit spektrofotometr Agilent Cary 3500 multicell. Sken spektra byl proveden v rozsahu 250 až 350 nm s průměrovaným časem jedna sekunda a datovým intervalem 1 nm. Nebylo třeba jakékoliv předběžné nastavení. K prokázání opakovatelnosti bylo provedeno 20 opakovaných měření roztoku BSA o koncentraci 3 mg/ml s použitím 70 µl kyvety a s použitím identické kyvety a PBS pufrem jako reference. Dále byla proměřena také série 10 opakovaných měření s použitím 3,5 ml kyvety s optickou drahou 10 mm a opět byla použita i identická kyveta s roztokem PBS pufru jako reference. Všechna tato měření byla provedena při 278 nm s průměrovaným časem 1 sekunda a šířkou spektrálního pásma 2 nm.

Výsledky

Simultánní měření

Slepý vzorek a pět vzorků BSA byly měřeny souběžně pomocí Cary 3500 multicell. Sken spektra od 250 do 350 nm umožnil kvalitativní analýzu vzorků. Tato data byla poté použita pro posouzení linearity spektrofotometru (viz sekce linearita mikrokyvet).

HPST: Obr. 2: Skeny spektra roztoků BSA v 70 µl kyvetě měřené současně

Čistota proteinu

Hodnota absorbance při 350 nm může být použita pro kvantifikaci a zjištění přítomnosti případných nečistot ve vzorku proteinu. Obr. 2 ukazuje, že u měřených vzorků je absorbance při 350 nm nulová. Proto může být koncentrace BSA ve vzorku stanovena jako přímá úměra intenzity maximálního píku ve spektru, aniž by bylo třeba korekce vůči nečistotám vzorku.

Linearita měření v mikrokyvetách

Každý sken spektra ukázal maximální pík při 278 nm (obr. 2). Pomocí softwaru Cary UV Workstation byla pro každý vzorek extrahována hodnota absorbance a vynesena proti hodnotě koncentrace jednotlivých vzorků (obr. 3). Získaná data jasně prokazují linearitu použitého systému Cary 3500. I s použitím kyvet o ultra nízkém objemu s malou aperturou bylo dosaženo lineárního rozsahu až do 2,5 A.

HPST: Obr. 3: Linearita Cary 3500 vyjádřená vynesením hodnot absorbance při 278 nm proti hodnotám koncentrace pěti vzorků BSAp

Opakovatelnost

Pro demonstraci opakovatelnosti bylo provedeno 20 opakovaných měření vzorku s BSA o koncentraci 3 mg/ml v 70 µl kyvetě (apertura 2 x 2,5 mm) a v 3,5ml kyvetě (obě kyvety s optickou drahou 10 mm). Obr. 4 ukazuje, že opakovatelnost pro 70 ul kyvetu nebyla ovlivněna velikostí apertury této kyvety. Standardní odchylka opakovaných měření byla 0,00042 pro 70 µl kyvetu a 0,00029 pro 3,5 ml kyvetu.

HPST: Obr. 4: Absorbance 20 opakovaných měření v 70 µl kyvetě ve srovnání s 20 měřeními ve standardní 3,5 ml kyvetě

Průměrná hodnota absorbance jednotlivých měření byla 1,863 Abs pro 70 µl kyvetu a 1,858 Abs pro 3,5 ml kyvetu.

Při použití kyvet s ultra nízkým objemem je rizikem menší množství záření, který projde přes kyvetu v důsledku malé apertury těchto kyvet. V důsledku toho pak dochází k poklesu linearity i opakovatelnosti měření. Toto neplatí pro Cary 3500, který má velmi fokusovaný paprsek a nedochází tak ke ztrátám záření při průchodu malou aperturou. Cary 3500 dosahuje stejné opakovatelnosti měření v kyvetách s ultra nízkým objemem jako v kyvetách se standardním objemem 3,5 ml.

Diskuse

Kvantitativní měření lze provést na základě znalosti absorpčního maxima v UV-Vis spektru a znalosti absorpčního koeficientu. U vzorků, jako je BSA, známe hodnotu absorpčního koeficientu. Pokud tuto hodnotu neznáme je možné ji určit z rovnice kalibrační křivky vycházející z opakovaných měření standardů o různé koncentraci. Tento proces může být náročný a může přinést chyby, které se projeví až na konci experimentu.

Zvýšení jistoty experimentu lze dosáhnout přidáním vzorků o známé koncentraci do analytické sekvence, které pak fungují jako vnitřní kontroly. Úskalím těchto měření je, že vzorky a standardy nejsou měřeny ve stejný čas. V čase mezi jednotlivými měřeními pak může docházet ke změnám proměnných hodnot. Tento článek dokazuje, že měření standardů a vzorků ve stejný okamžik může velmi dobře potlačit chyby plynoucí z okolního prostředí.

K chybám může často docházet u nestabilních vzorků. V čase, který uplyne, než je vzorek změřen, může dojít ke změně absorbance. Toto se může stát v důsledku změny teploty, v důsledku dopadajícího světla nebo v důsledku chemické reakce ve vzorku. Výsledkem jsou systematické chyby při kvantifikačních měřeních. Těchto chyb se můžete zbavit díky možnosti simultánního měření pomocí Cary 3500 multicell a zvýšíte tak jistotu správnosti vašich výsledků. Současně znatelně ušetříte čas.

Závěr

Cary 3500 multicell představuje nové možnosti pro kvantitativní i kvalitativní analýzu proteinů.

Tento systém s jedinečným integrovaným a nepohyblivým držákem na osm kyvet je stvořen pro produktivitu a opakovatelnost. Díky možnosti měření ve všech osmi pozicích zároveň dochází k efektivnímu potlačení nechtěných proměnných, které mohou vznikat při po sobě jdoucích jednotlivých měřeních. Tyto vlastnosti dohromady dělají z Cary 3500 velmi výkonný analytický nástroj.

Pro Vaše dotazy kontaktujte: Martina Háková (Produktový specialista (FTIR, UV-Vis-NIR, fluorescence, Raman), 730 572 998, [email protected])