Organická analýza - Elektroanalytické metody - Ampérometrie

9 ELEKTROANALYTICKÉ METODY

9.3 Ampérometrie

• 9.3.1 Ampérometrické senzory
  • 9.3.1.1 Clarkovo kyslíkové čidlo
  • 9.3.1.2 Enzymové biosenzory
  • 9.3.1.3 Tkáňové a bakteriální biosenzory
• 9.3.2 Ampérometrické detektory
  • 9.3.2.1 Průtokové cely
  • 9.3.2.2 Pracovní elektrody pro průtoková měření
  • 9.3.2.3 Měřící techniky
  • 9.3.2.4 Použití ampérometrické detekce v průtokové analýze organických látek

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Ampérometrie

Ampérometrie, podobně jako voltametrie, je elektroanalytická metoda, která využívá přenos elektronů mezi analytem a elektrodou, tedy oxidaci nebo redukci analytu. Na pracovní elektrodu se vkládá konstantní potenciál a měří se velikost procházejícího proudu, která je úměrná koncentraci analytu. Konstantní potenciál se obvykle nastavuje tak, aby elektrodou procházel limitní proud analytu [1]. Instrumentace pro ampérometrickou analýzu je v principu stejná jako pro analýzu voltametrickou.

V praxi se ampérometrie využívá zejména pro analýzu látek v míchaných či proudících médiích – kapalinách nebo plynech. Sleduje se obvykle závislost proudu na čase (chronoampérometrie). Selektivita ampérometrické analýzy s běžnými kovovými či uhlíkovými elektrodami je obecně malá, i když ji jistě lze do jisté míry ovlivnit potenciálem elektrody, neboť různé látky se oxidují či redukují při různých potenciálech. Proto se potřebná selektivita metody zajišťuje vhodnou modifikací pracovní elektrody či použitím vhodné separační techniky před ampérometrickou detekcí. Podle účelu použití se konstruují detekční cely různých tvarů a uspořádání. V následujících odstavcích budou zmíněny analyticky nejvýznamnější typy ampérometrických detektorů.

Ampérometrické senzory

CLARKOVO KYSLÍKOVÉ ČIDLO

Ampérometrie se velmi často používá ke stanovení plynných látek v kapalných vzorcích. K těmto účelům navrhl a zkonstruoval vhodnou detekční celu Leland C. Clark v r. 1957. Clark řešil problém, jak stanovit kyslík v krvi. Krev představuje nesmírně složitou matrici obsahující látky, které se adsorbují na povrch běžně používaných redoxních elektrod, uhlíkových i kovových, a tím snižují jejich aktivitu, což se projeví poklesem až ztrátou proudové odezvy. Clark jednoduše oddělil elektrody a elektrolyt od analyzovaného prostředí (krve) membránou propustnou pouze pro plyny a tím zamezil přístup ostatních složek vzorku k povrchu indikační platinové elektrody, čímž zabránil její pasivaci.

Schéma Clarkova kyslíkového senzoru je na obr. níže. Kyslík difunduje z analyzovaného prostředí přes membránu (např. teflonovou, polypropylenovou nebo silikonovou) a tenkou vrstvu elektrolytu k platinové elektrodě, kde je redukován:

• O₂ + 4H⁺ + 4e⁻ → 2H₂O

2 THETA: Schéma Clarkova kyslíkového senzoru: (A) Pt-elektroda, (B) Ag/AgCl-elektroda, (C) roztok KCl, (D) plynopropustná membrána, (E) těsnící gumový kroužek, (F) zdroj napětí, (G) ampérmetr.

ENZYMOVÉ BIOSENZORY

Clarkovo čidlo se stalo základem membránových biosenzorů. V praxi nejčastěji používaný je biosenzor pro stanovení glukosy, který slouží zejména diabetikům ke sledování hladiny jejich krevní glukosy. První glukosový senzor obsahoval enzym glukosaoxidasu imobilizovanou na dialyzační membráně kyslíkového čidla. Glukosa obsažená v analyzovaném vzorku je v přítomnosti enzymu a kyslíku oxidována za vzniku kyseliny glukonové (resp. glukonolaktonu) a peroxidu vodíku:

2 THETA: Glukosa

Kyslíkové čidlo při této reakci deteguje úbytek kyslíku, který je úměrný koncentraci glukosy. Nevýhodou uvedeného měřicího systému je, že odezva elektrody závisí na koncentraci kyslíku v enzymové vrstvě. Pokud poklesne koncentrace kyslíku, který oxiduje glukosu, sníží se i proudová odezva kyslíkového senzoru a naměřená výsledná koncentrace glukosy může být podhodnocená.

Jinou možností je detegovat produkt reakce, peroxid vodíku, který se na platinové elektrodě oxiduje při vhodném potenciálu (+0,6 V proti Ag/AgCl): H₂O₂ → O₂ + 2H⁺+ 2e⁻

Další řešení problému závislosti odezvy senzoru na koncentraci kyslíku spočívá v náhradě kyslíku nefyziologickou sloučeninou schopnou přenášet elektrony mezi analytem a elektrodou. Takové sloučeniny se nazývají mediátory. Mediovaný přenos elektronů (obr. A níže) je využíván v tzv. druhé generaci enzymových senzorů.

2 THETA: Sekvence přenosu elektronů mezi analytem (glukosou) a elektrodou v systému s mediátorem v glukosových biosenzorech druhé generace (A). Strukturní vzorec ferrocénu (B), mediátoru používaného v glukosových senzorech druhé generace [3].

Mediátory jsou na elektrodě regenerovány při nižších potenciálech, při kterých obvykle nedochází k interferujícím reakcím elektroaktivních látek v matrici vzorku. Příkladem mediátoru používaného v glukosových senzorech je ferrocén (obr. B výše), který zprostředkovává přenos elektronů z glukosaoxidasy na elektrodu podle schématu [3]:

• glukosa + glukosaoxidasa (ox) → glukonová kyselina + glukosaoxidasa (red)

• glukosaoxidasa (red) + 2 ferrocén (ox) → glukosaoxidasa (ox) + 2 ferrocén (red) + 2H⁺

• 2 ferrocén (red) → 2 ferrocén (ox) + 2e⁻

kde (ox) a (red) značí oxidovanou a redukovanou formu příslušné látky. Ferrocén se na elektrodě regeneruje již při potenciálu +0,2 V proti Ag/AgCl, tedy o 0,4 V nižším, než je třeba k oxidaci peroxidu vodíku. Toto snížení potenciálu zlepšilo stabilitu odezvy senzoru i jeho selektivitu.

Popsaný princip umožnil vývoj osobních bateriových glukometrů pro monitorování hladiny krevní glukosy z jediné kapky krve. Levné jednorázové senzory (tzv. testovací proužky), které se používají v těchto zařízeních, jsou plastové destičky (např. z PVC), na které se sítotiskem nanesou uhlíkové elektrody se směsí glukosaoxidasy a mediátoru a překryjí se hydrofilní membránou (obr. níže).

2 THETA: Schématické znázornění jednorázového testovacího proužku s glukosovým biosenzorem druhé generace používaným v osobních glukometrech [4].

Vývoj glukosových senzorů jde neustále kupředu. Navázání enzymu na povrch elektrody pomocí vodivých polymerů zajišťuje rychlou (bezdifúzní) elektrickou komunikaci mezi enzymem a elektrodou. Tohoto principu se využívá v implantovatelých biosenzorech pro téměř bezbolestné monitorování krevní glukosy. Tyto senzory mohou bezdrátově komunikovat s automatickými dávkovači insulinu. U diabetických pacientů je tak možno automaticky regulovat obsah glukosy v krvi.

Příklady dalších v praxi používaných ampérometrických enzymových senzorů jsou uvedeny v tabulce.

2 THETA: Tabulka: Některé běžně používané ampérometrické enzymové biosenzory [3,5].

Spolehlivá detekce alkoholu je důležitá v mnoha oborech. K tomuto účelu lze využít enzymovou reakci ethanolu s koenzymem nikotinamidadenindinukleotidem (NAD⁺) v přítomnosti enzymu alkoholdehydrogenasy (ADH).

TKÁŇOVÉ A BAKTERIÁLNÍ BIOSENZORY

Omezená stabilita izolovaných enzymů, jejich vysoká cena a navíc v mnoha případech nedostupnost enzymů v čisté formě vedla k využití buněčných systémů (rostlinných tkání, bakteriálních buněk apod.) obsahujících požadované enzymy při konstrukci biosenzorů. Přirozené prostředí, v němž se enzym nachází, obvykle prodlužuje jeho aktivitu a životnost, což zvyšuje stabilitu a dobu použitelnosti příslušného senzoru.

Příkladem rostlinné tkáně výborně využitelné v biosenzorech je banánová dužnina, která obsahuje enzym polyfenoloxidasu (PPO). Tento enzym katalyzuje oxidaci dopaminu.
Reakcí vznikající o-chinon je elektroaktivní látka, která může být snadno redukována na pracovní elektrodě zpět na původní dihydroxysloučeninu. Reakcí vznikající o-chinon je elektroaktivní látka, která může být snadno redukována na pracovní elektrodě zpět na původní dihydroxysloučeninu.

Ampérometricky se sleduje proud vzniklý redukcí chinonu. Jednoduchý biosenzor pro stanovení dopaminu je založen na modifikované uhlíkové pastové elektrodě, která se připraví smícháním grafitového prášku, parafinového oleje a rozetřené banánové dužniny. Homogenizovanou pastou se naplní tělo elektrody (např. skleněná či plastová trubička) s elektrickým kontaktem, např. měděným drátem. Biosenzor využívající banánovou dužninu jako zdroj polyfenoloxidasy byl výstižně nazván „banántroda“

Další biosenzory využívají spojení mikroorganismů s elektrochemickými převodníky. Mikroorganismy mohou být imobilizovány na povrchu elektrod, podobně jako enzymy, pomocí gelů, polymerních vrstev nebo uzavřením mezi membrány. Změny v respirační aktivitě mikroorganismů způsobené cílovým analytem vedou ke snížení povrchové koncentrace kyslíku, který lze detegovat kyslíkovým ampérometrickým čidlem. Uvedený princip se využívá např. k detekci toxických sloučenin, ale i ke stanovení biologické spotřeby kyslíku [3,5].

Ampérometrické detektory

Ampérometrie bývá využívána pro citlivou detekci elektroaktivních látek v průtokových systémech, jako jsou průtoková vstřikovací analýza (FIA), kontinuální průtoková analýza (CFA), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) a kapilární elektroforéza (CE). První dvě techniky nerozdělují složky analyzovaných vzorků. V průtokové vstřikovací nebo kontinuální analýze komplikovanějších např. biologických vzorků se proto k zajištění požadované selektivity s výhodou využívají detekční principy popsané v předchozí kapitole (modifikace pracovní elektrody vhodnou omezeně propustnou membránou či polymerní vrstvou, enzymy a dalšími biokatalytickými či bioafinitními složkami). Další možností, jak zvýšit selektivitu FIA a CFA je předběžná úprava vzorku např. extrakcí tuhou fází (SPE).

PRŮTOKOVÉ CELY

Objem ampérometrického detektoru by měl být co nejmenší, zejména pro detekci v HPLC a CE, kde je nežádoucí rozmývání separovaných zón vzorku [1,8]. Obecně platí, že objem detekční cely by neměl přesáhnout objem teoretického patra, což je parametr charakterizující separační účinnost metody. V ampérometrických detektorech, které využívají povrchové reakce (oxidace nebo redukce) analytu je co nejmenší objem cely rovněž žádoucí pro rychlý a reprodukovatelný transport analytu k elektrodě. V praxi se využívají tři základní konstrukční typy detekčních cel: tenkovrstvá, „wall-jet“ a tubulární (obr. níže).

2 THETA: Konstrukční typy ampérometrických průtokových cel: A – tenkovrstvá, B – „wall-jet“, C – tabulární; 1 – pracovní elektroda, 2 – vstup kapaliny, 3 – výstup kapaliny.

PRACOVNÍ ELEKTRODY PRO PRŮTOKOVÁ MĚŘENÍ

Nejčastěji používaným materiálem pracovních elektrod pro měření v průtokových ampérometrických detektorech jsou uhlík v různých formách (skelný uhlík, grafitová pasta, bórem dopovaný diamant) a drahé kovy, zejména platina a zlato. Elektrochemické vlastnosti elektrod z těchto materiálů jsou podrobněji popsány v předešlá kapitole. Rtuťové elektrody se používají pouze výjimečně, většinou ve formě rtuťového filmu na uhlíkové nebo platinové elektrodě či ve formě amalgamu na zlaté, stříbrné, příp. měděné elektrodě. Další materiály, jako jsou paladium, stříbro nebo měď, lze použít pro speciální účely. Volba vhodného materiálu závisí mimo jiné na šířce potenciálového okna (využitelného potenciálového rozsahu) potřebného pro reakci daného analytu. V tabulce jsou uvedeny potenciálové rozsahy některých elektrodových materiálů v prostředí octanového tlumivého roztoku o pH 4,5.

2 THETA: Přibližné využitelné potenciálové rozsahy některých elektrodových materiálů v octanovém pufru pH 4,5 [9].

MĚŘÍCÍ TECHNIKY

Ve většině aplikací ampérometické detekce v průtokových systémech se na pracovní elektrodu vkládá konstantní potenciál (odpovídající limitnímu proudu analytu) a registruje se proud v čase. V řadě případů, zejména při oxidaci analytů, však dochází k pasivaci povrchu elektrody reakčními produkty. Efektivní čištění a regeneraci elektrodového povrchu lze provádět měřením v pulsním režimu (obr. níže). Pracovní potenciál E₁, při kterém se deteguje cílový analyt, se střídá s pulsy pozitivního potenciálu (E₂), při kterém se oxiduje povrch elektrody a negativního potenciálu (E₃), kdy se povrchové oxidy redukují. Pulsy mohou být různě dlouhé a mohou se několikrát opakovat před dalším měřením proudového signálu. U platinových elektrod se obvykle zařazuje ještě potenciálový puls E₄, při němž je desorbován vodík z povrchu elektrody (obr. B). Proudový signál se obvykle snímá pouze po velmi krátkou dobu tm (typicky desítky až stovky milisekund).

2 THETA: Příklady polarizačních pulsů vkládaných na pracovní elektrodu v pulsní ampérometrii. E₁ – pracovní potenciál, E₂ – potenciál kladného čistícího pulsu, E₃ – potenciál záporného čistícího pulsu, E₄ – potenciál desorpce vodíku, t₁ - t₄ – doba trvání pulsů, tm – doba, po kterou se měří proud.

Další možností je použití tzv. reverzního pulsního režimu, který je výhodný např. při FIA stanovení obtížněji oxidovatelných látek na planární elektrodě ze skelného uhlíku [9].

POUŽITÍ AMPÉROMETRICKÉ DETEKCE V PRŮTOKOVÉ ANALÝZE ORGANICKÝCH LÁTEK

Ampérometrická detekce se častěji používá ke stanovení oxidovatelných látek. Typickými analyty jsou fenolové sloučeniny, které se poměrně snadno oxidují na uhlíkových elektrodách. Látky obsahující více fenolových skupin (deriváty katecholu a hydrochinonu) se redukují velmi snadno a reverzibilně za vzniku příslušných chinonů. Významnými analyty ze skupiny fenolů a polyfenolových látek jsou např. katecholaminy (dopamin, noradrenalin, adrenalin) a rostlinné polyfenoly (fenolové kyseliny, flavonoidy). Fenolovou skupinu obsahuje celá řada farmaceutik, antioxidantů či pesticidů. Další skupinou oxidovatelných látek jsou aromatické aminy (aniliny, fenylendiaminy, benzidiny, aminofenoly), které se rovněž stanovují nejčastěji na uhlíkových elektrodách. K detekci cukrů a aminokyselin po HPLC nebo CE separaci se obvykle používají měděné elektrody. Thioly se snadno oxidují na disulfidy. Ke stanovení thiolů lze využít tvorby jejich komplexů se rtutí, které se oxidují již při velmi nízkých potenciálech (kolem +0,1 V). Takto lze selektivně stanovit např. aminokyselinu cystein, tripeptid glutathion či některá farmaceutika (penicilamin, captopril). Pomocí duálního detektoru lze v jednom chromatografickém experimentu stanovit thioly i odpovídající disulfidy [9]. Také sulfonamidy, které jsou farmaceuticky využívanou skupinou látek, mohou být detegovány ampérometricky. Z dalších analyticky významných látek, k jejichž stanovení byly vyvinuty separační metody s ampérometrickou detekcí, lze jmenovat např. kyseliny askorbovou a močovou, kofaktor NADH, indoly a další biochemicky a farmaceuticky významné heterocykly, např. fenothiaziny, deriváty piperidinu a piperazinu.