Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 2/4

5.5 Instrumentace v HPLC

• 5.5.1 Zásobníky, úprava a čerpání mobilní fáze
• 5.5.2 Systémy pro tvorbu gradientu mobilní fáze
• 5.5.3 Dávkování vzorků
• 5.5.4 Detektory pro HPLC

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Instrumentace v HPLC

Přístroje pro HPLC - kapalinové chromatografy se mohou sestavit z jednotlivých prvků (modulů): zásobníků a zařízení pro úpravu mobilní fáze, vysokotlakého čerpadla, často v úpravě pro možnost tvorby gradientu mobilní fáze, dávkovače vzorků, temperované skříně pro umístění chromatografické kolony, detektoru, poskytujícího elektrický signál při průchodu separovaných látek z kolony, zařízení pro elektronické zpracování časové závislosti elektrického signálu detektoru, vyhodnocování a zpracování chromatografických dat a grafickou prezentaci chromatogramů pomocí integrátoru či počítače. Častěji se používají kompaktní přístroje, kde jsou všechny prvky propojené, a můžeme zvolit jejich různé kombinace podle požadovaných parametrů [20-22].

Zásobníky, úprava a čerpání mobilní fáze

Zásobníky mobilní fáze tvoří zpravidla skleněné lahve o kapacitě 1 - 2,5 litrů, opatřené trubicemi pro přívod helia, na konci s fritou, která složí k rovnoměrnému rozptýlení bublinek v objemu zásobníku. Probublávání heliem, které se velmi málo rozpouští v mobilní fázi, slouží k odplynění (odstranění rozpuštěného vzduchu) z mobilní fáze, aby se zabránilo jejich uvolnění ve ventilech čerpadel a při směšování složek gradientu mobilní fáze, kde by narušovaly plynulost toku mobilní fáze a přesnost retenčních časů, a v detektoru, kde by rušily hladký záznam signálu a zhoršovaly citlivost a přesnost kvantitativní analýzy. Pro dokonalejší odplynění lze použít vakuový průtočný odplyňovač, což je polopropustná membrána ve tvaru kapilární trubice, umístěná ve vakuové komoře před vstupem na kolonu. Rozpuštěný plyn z mobilní fáze prochází stěnou membrány do prostoru se sníženým tlakem. Před vstupem do čerpadla prochází mobilní fáze průtočným filtrem (fritou s póry 0,5 - 2 μm), odstraňující případné drobné tuhé částečky.

Čerpadla mobilní fáze zabezpečují přesný bezpulzní transport mobilní fáze při pracovním tlaku až 40 MPa u konvenční HPLC, a do 100 - 150 MPa při technice UHPLC. Konstrukční materiál musí být odolný proti korozi i při použití poměrně agresivních mobilních fází (např. slabě kyselých tlumivých roztoků - nerezová ocel, titan, keramika).

V začátcích HPLC se používala jednoduchá pneumatická čerpadla, pracující při konstantním tlaku. V současné době se pro HPLC většinou používají pístová čerpadla, která pracují s konstantním objemovým průtokem mobilní fáze. Konstrukce vychází z principu injekční stříkačky, spojené se zásobníkem mobilní fáze a s vysokotlakou částí přístroje přes zpětné ventilky, které se střídavě otvírají a zavírají při střídavém pohybu pístu vpřed (výtlak) a zpětném pohybu (sání).

Systémy pro tvorbu gradientu mobilní fáze

Cílem gradientové eluce je urychlení separace a zvětšení počtu separovaných látek (píkové kapacity) v průběhu jedné separace. Podle nastaveného programu se směšují dvě nebo více složek mobilní fáze tak, aby s časem rostla koncentrace složky mobilní fáze s větší eluční sílou a urychlila se eluce silněji zadržovaných látek. Gradientové chromatografy se mohou použít i ke směšování mobilních fází, jejichž složení se v průběhu eluce nemění. V praxi se používají přístroje s tvorbou gradientu buď v nízkotlaké, nebo ve vysokotlaké části přístroje [23].

a) V nízkotlakém systému se složky mobilní fáze mísí v malé směšovací komůrce před vstupem do vysokotlakého čerpadla, přičemž poměr směšovaných složek se řídí podle časového programu, který mění poměr doby, po kterou se v krátkém pracovním cyklu střídavě otvírají a zavírají proporcionální (solenoidní) ventily na přívodním potrubí jednotlivých složek mobilní fáze (Obr. 5.10i). Přesnější je programování průtoku dvou či tří pomocných nízkotlakých mikročerpadel, dávkujících jednotlivé složky (Obr. 5.10ii).

b) Ve vysokotlakém systému dávkuje každou složku mobilní fáze vlastní vysokotlaké čerpadlo do směšovací komůrky před kolonou. Průtok každé složky se mění tak, aby celkový průtok zůstával v průběhu gradientu konstantní (Obr. 5.10iii).

2 Theta: Obr. 5.1 Nízkotlaké (i, ii) a vysokotlaké (iii) systémy pro gradientovou eluci.

Dávkování vzorků

Vzorky se zavádějí na kolonu kapalinového chromatografu dávkovacími ventily se smyčkou předem naplněnou vzorkem, bez přerušení toku mobilní fáze. U manuálně ovládaných ventilů se vzorek se dávkuje ručním přepnutím ventilu do druhé polohy. Plnění smyčky i přepínání poloh ventilu je u automatických dávkovačů ovládáno pneumaticky nebo elektricky a je řízeno počítačem. V nejjednodušším případě má dávkovací smyčka fixní vnitřní objem a pro dávkování jiných objemů je třeba smyčku vyměnit. Dávkovače s volitelným objemem smyčky mají složitější konstrukci, požadovaný objem vzorku se zavádí pomocí servomotorem ovládané injekční stříkačky pouze do části smyčky.

Detektory pro HPLC

Do detektorů se zavádí eluát z chromatografické kolony. Detektory selektivní poskytují signál úměrný pouze koncentraci analyzované látky v eluátu, kdežto detektory univerzální signál úměrný určité vlastnosti eluátu jako celku, separovaných látek i mobilní fáze [26].

V současné praxi HPLC se standardně používají spektrofotometrické detektory pracující v ultrafialové, případně i ve viditelné oblasti elektromagnetického záření (od 190 do 600 nebo do 800 nm).

Vlnovou délku detekce u levnějších přístrojů s nízkotlakou rtuťovou výbojkou jako zdrojem záření vymezuje interferenční filtr (253,7 nm). Detektory vybavené deuteriovou výbojkou jako zdrojem spojitého záření a monochromátorem, umožňují zvolit vlnovou délku detekce, většinou v rozsahu od 190 do 600 nm. Některé přístroje tohoto typu umožňují snímat UV spektra látek v měrné kyvetě při zastaveném průtoku mobilní fáze (stop-flow technika), u rychle skenujících spektrofotometrů i bez přerušení toku.

2 Theta: Obr. Schéma detektoru s diodovým polem; (1) záření ze zdroje, (2) štěrbina, (3) čočka, (4) clona, (5) měrná cela detektoru, (6) holografická mřížka, (7) pole fotodiod

Spektrofotometrické jednopaprskové detektory s fotodiodvým polem (photodiode-array, PDA) mají velký počet (512 - 1024) plošných fotodiod, umístěných na křemíkové destičce o délce cca 1 - 2 cm, na něž dopadá záření po průchodu měrnou celou a spektrálním rozkladu holografickou mřížkou.

Vysoce selektivní a citlivé jsou fluorimetrické detektory. Fluoreskující látka v cele detektoru absorbuje budicí záření z ultrafialové oblasti, jehož část vyzáří ve formě sekundárního záření o vyšší vlnové délce, které se zpravidla měří pod úhlem 90° k záření budicímu.

Další skupinou selektivních a citlivých detektorů jsou detektory elektrochemické, které poskytují odezvu pro elektroaktivní, (redukovatelné či oxidovatelné) látky.

Amperometrické detektory pracují v rovnovážném stavu, kde na povrchu. měrné elektrody podléhá reakci jen malé množství látky. Vedle dvouelektrodového zapojení se používá i zapojení tříelektrodového s pomocnou elektrodou pro lepší stabilitu signálu. Měrná elektroda je zhotovena ze skelného uhlíku, grafitových vláken či grafitové pasty, platiny, zlata, mědi, niklu, nebo z drátů a disků, potažených různými amalgámy rtuti (podle typu elektrochemické reakce) a má buď tvar průtočné kapiláry, nebo disku či tyčinky s leštěným povrchem, obtékaným eluátem z kolony. Časem se zanáší reakčními produkty a je ji třeba pravidelně čistit. Miniaturizované měrné cely lze používat v mikrokolonové nebo kapilární HPLC. Detektory jsou selektivní a jejich citlivost je mnohdy srovnatelná s detektory fluorimetrickými, nehodí se ale pro použití při gradientové eluci. Ještě citlivější jsou coulometrické detektory, které pracují s průtočnými elektrodami ve formě frit z pórovitého grafitického uhlíku s vysokým měrným povrchem, na němž probíhají elektrochemické reakce analyzovaných látek.

Vodivostní detektory měří elektrickou vodivost eluátu z kolony v průtokové cele, obvykle válcového tvaru, se dvěma vzájemně izolovanými kovovými elektrodami. Pracují s vloženým střídavým napětím, aby nedocházelo k polarizaci elektrod. Používají se téměř výhradně pro detekci iontových látek při tzv. iontové chromatografii.

Pro látky, které nemají fyzikálně-chemické vlastnosti umožňující selektivní detekci, je třeba použít detektory univerzální. Z nich je nejstarší refraktometrický detektor, který při průchodu látky poskytuje odezvu úměrnou rozdílu indexu lomu mezi měrnou kyvetou a kyvetou srovnávací, naplněnou čistou mobilní fází.

Univerzálním detektorem je i aerosolový detektor rozptylu světla (evaporative light-scattering detector, ELSD), který využívá zmlžení eluátu z kolony v proudu dusíku za tvorby jemných kapiček aerosolu. Z nich se ve vyhřívané oblasti odpaří mobilní fáze a průtokovou celou prochází aerosol tuhých mikročástic vzorku v proudu plynu, na nichž dochází k rozptylu světla, které vychází z kolmo umístěného laserového zdroje.

Pro každou aplikaci je třeba optimalizovat teplotu odpařování mobilní fáze a průtok plynu. Stejného principu využívá víceúhlový rozptylový detektor (multi-angle light-scattering detector, MALSD), používaný při chromatografii syntetických polymerů, kde lze získat údaje o molekulové váze na základě porovnání intenzity rozptylového záření při třech nebo více úhlech dopadu budicího záření. Podobný ELSD je i CNLSD detektor (condensation nucleation light-scattering detector), kde po odpaření mobilní fáze kondenzují tuhé částice s přesycenou vodní parou na větší kapičky, čímž se zvětší rozptyl světla a zlepší citlivost detekce. Detektor nabitého aerosolu (charged aerosol detector, CAD) neměří rozptyl záření, ale působí na aerosol vysokonapěťovým koronovým výbojem na elektrodě, který aerosol ionizuje.

Rámec pouhé detekce přesahují přímé (on-line) kombinace HPLC se spektrálními technikami, s NMR [30] a především s hmotnostní spektrometrií (spojení HPLC-MS) [8], jejichž aplikace se stále rozšiřují. HPLC-MS techniky spojují výhody univerzální a vysoce selektivní detekce s možností identifikace složek vzorku, získání informací o molárních hmotnostech a o struktuře separovaných látek. Velký pokrok ve vývoji přímého spojení HPLC-MS znamenalo zavedení "měkkých" technik ionizace při atmosférickém tlaku, kdy nedochází k rozsáhlé fragmentaci a lze zaznamenat píky molekulových iontů či jejich aduktů i pro velmi polární a tepelně nestálé látky. Jedná se o ionizaci elektrosprejem (ESI) chemickou ionizaci při atmosférickém tlaku (APCI) a fotoionizaci při atmosférickém tlaku (APPI) či ionizaci-desorpcí laserem za podpory matrice (MALDI). Jako analyzátory se používají především kvadrupóly (Q), iontové pasti (IT), orbitální pasti a průletové analyzátory (TOF).

Přímé spojení HPLC-ESI MS se v dnešní době stalo široce využívanou standardní technikou, zejména pro biopolymery (peptidy, proteiny), které za podmínek ionizace tvoří vícenásobně nabité ionty, což umožňuje analyzovat i látky s molekulovými hmotnostmi až do cca 150 000.