Organická analýza - Využití Superkritické Fluidní Chromatografie

4.5 Využití SFC v současné praxi

4.6 Další využití SFC

• 4.6.1 Využití SFC k izolaci analytů - preparativní SFC
• 4.6.2 Využití SFC pro měření distribučních konstant v systému scCO₂ – IL

4.7 Závěr

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Využití SFC v současné praxi

Vzhledem k tomu, že SFC (Superkritická Fluidní Chromatografie) je poměrně novou technikou, mnoho publikovaných prací se stále věnuje fundamentálním otázkám. Významnou oblastní SFC analýz jsou však také chirální separace. SFC je mnohonásobně úspěšnější ve schopnosti rozlišovat enantiomery než LC či elektroforéza, a to i přesto, že přesný mechanismus těchto chirálních separací zatím nebyl detailně objasněn [17]. Nízká robustnost a opakovatelnost SFC separací dlouho bránila rutinními používání SFC techniky v regulovaném prostředí, např. v laboratořích kontroly kvality v rámci farmaceutického průmyslu a dalších [30]. To se změnilo v roce 2012 představením moderní SFC instrumentace a počet SFC metod v tomto oboru každý rok roste. V roce 2020 byla navíc provedena první mezilaboratorní studie zkoumající přenositelnost SFC metody pro stanovení nečistot salbutamolu mezi laboratořemi [51], která prokázala srovnatelné výsledky reprodukovatelnosti u této SFC metody jako v případě zavedené LC metody.

2 THETA: Obr. Rozdělení publikovaných SFC metod (1962 – 2021) dle jednotlivých aplikačních odvětví. Převzato ze zdroje [2] a aktualizováno.

Mezi první aplikační obory SFC techniky po jejím představení patřila především analýza nepolárních sloučenin, jako jsou oleje, surfaktanty, polymery, vosky a tuky, za použití čistého CO₂ a gradientu tlaku [2]. Díky zavedení organického modifikátoru do mobilní fáze a představení robustní instrumentace se však v dnešní době SFC úspěšně používá v mnoha dalších odvětvích včetně farmaceutické analýzy, bioanalýzy a analýzy potravin. Vzhledem k tomu, že je možno prakticky neomezeně kombinovat CO₂, organický modifikátor a široké spektrum stacionárních fází, je SFC schopná analyzovat tytéž směsi jako HPLC na reverzních fázích, HPLC na normálních fázích, HILIC a částečně také iontově-párová a iontově-výměnná chromatografie. Aplikovatelnost SFC samozřejmě klesá s rostoucí polaritou analyzovaných látek a analýza proteinů v SFC zůstává prozatím problematická.

2 THETA: Obr. Vhodnost jednotlivých chromatografických metod pro analýzu látek v závislosti na jejich rostoucí polaritě. Převzato ze zdroje [3].

Analýza polárních a ionizovatelných látek jako jsou polární léčiva, metabolity a aminokyseliny může být v SFC problematická. K těmto separacím se většinou využívá gradientová eluce s více něž 40 % organického modifikátoru s polárním aditivem. SFC-MS byla úspěšně použita pro dopingovou analýzu [18], kdy byla zajištěna vysoká prostupnost vzorků a citlivá detekce stovek analytů během 6 minut. Byly publikovány taktéž SFC-MS separace metabolitů ketaminu a 60 dalších polárních metabolitů v moči. Úspěšnou SFC-MS separaci polárních aminokyselin publikovala Wolrab a kol. [52]. Možnost separovat v rámci jedné SFC analýzy látky s rozdílnou polaritou pak dokazuje Obr. 4.17. Zde byla pomocí SFC v rámci 5 minut úspěšně separována směs lipofilních a hydrofilních vitamínů [53].

2 THETA: Obr. UHPSFC-MS separace 17 vitamínů. (1) retinol acetát, (2) retinol palmitát, (3) D2, (4) α-tokoferol, (5) K2, (6) K1, (7) α-tokoferol acetát, (8) β-karoten, (9) nikotinamid, (10) kyselina nikotinová, (11) pyridoxin, (12) kyselina d-pantothenová, (13) biotin, (14) thiamin, (15) riboflavin, (16) B12, (17) C. Podmínky: kolona ACQUITY UPC2 HSS C18SB (50 × 3.0 mm, 2 μm), organický modifikátor: methanol/voda (95/5) s 0.2% mravenčanu amonného, několika kroková gradientová eluce z 2 do 100 % organického modifikátoru v CO2, průtok 1.2 ml/min, teplota 40°C, tlakový gradient z 15.2 MPa na 10.3 MPa [53].

Ve spojení s citlivou MS detekcí jsou SFC metody úspěšně používány také v monitorování lékových hladin, environmentální analýze, analýze potravin a rostlinných extraktů, forenzní analýze a především analýze lipidů a dalších lipofilních sloučenin. V porovnání s ostatními chromatografickými metodami, SFC-MS poskytuje vysoké rozlišení a citlivost při analýze nepolárních lipidů a metabolitů. Další výhodou bývá také kratší příprava vzorků před SFC-MS analýzou, jelikož není nutné upravený vzorek převádět do polárního rozpouštědla. Toho bylo využito také v případě SFC-MS metody pro analýzu 8 forem vitamínu E v lidském séru, kdy pro přípravu vzorku byla využita proteinová precipitace následovaná extrakcí z kapaliny do kapaliny. Separace těchto 8 tokoferolů a tokotrienolů pak bylo dosaženo v rámci 2.5 min s přímým nástřikem hexan/dichlormethanového extraktu (Obr. 4.18) [54]. Ukázka SFC-MS separace tříd lipidů je uvedena na Obr. 4.19 [55].

2 THETA: Obr. UHPSFC-MS separace 8 forem vitamínu E. Isokratická eluce s CO₂ a 5 % organického modifikátoru, tj. 10 mmol/l mravenčan amonný v methanolu, průtok 1,5 ml/min, 50°C, 13.0 MPa [54].

SFC je zvláště atraktivní pro analýzu tepelně labilních látek, kde při použití GC (HighTemperature GC) dochází k pyrolytickému znehodnocení analytů. Příkladem může být SFC analýza materiálu historických pečetí z doby Rudolfa II. GC analýza vyžaduje pro zplynění a pro eluci vzorku teploty, při kterých již dochází k nežádoucímu rozkladu vzorku.

Další využití SFC

Využití SFC k izolaci analytů - preparativní SFC

Kromě využití nadkritického CO₂ k separacím, kdy je cílem co nejlépe a nejrychleji separovat složité směsi látek, často pouze ve stopových koncentracích, nabývá na významu i využití SFC k izolaci většího množství látek - preparativní SFC. Kolona je v tomto případě mnohem více zatížena a volí se takové podmínky, aby byly co nejrychleji separovány cílové látky, které jsou následně odděleny do jednotlivých frakcí.

Volba nadkritické mobilní fáze přináší (v porovnání s kapalinovou preparativní chromatografií) některé specifické výhody:

1. Dosažitelná rychlost separací je typicky 3-5 krát vyšší oproti HPLC.

2. Analyty jsou získány ve vysoké koncentraci. Při použití nemodifikovaného CO₂ jsou získány přímo čisté látky díky snadnému odpaření CO₂, pokud je použit modifikátor tak jsou získány vysoce koncentrované roztoky nebo suspenze.

3. Šetrná k životnímu prostředí. Spotřeba organických rozpouštědel je redukována pouze na modifikaci CO₂ (typicky v rozsahu 5-20%). Mobilní fází je CO₂, který je levný, netoxický a šetrný k životnímu prostředí. Po chromatografické separaci na koloně dochází k oddělení mobilní fáze od analytů a CO₂ je recyklován, takže jeho spotřeba je minimalizována.

Schéma zařízení pro preparativní SFC je vyobrazeno a specifikováno v knize Organická analýza. Skládá se z čerpadel pro nadkritický CO₂ a modifikátor, které jsou poté míchány ve zvoleném poměru.

Využití SFC pro měření distribučních konstant v systému scCO₂ – IL

Kromě analytického využití je zajímavou aplikací SFC i její použití k získání fyzikálně chemických dat. Tato technika má již poměrně dlouhou historii v GC, kde lze takto měřit např. distribuční konstanty, G°, body varu, průběh adsorpční izotermy a povrch adsorbentu. [24] V souvislosti s rostoucím zájmem o termodynamické údaje v systémech s iontovými kapalinami (IL) je SFC velmi vhodná a rychlá metoda pro měření rozdělovacích koeficientů.

Iontové kapaliny (např. [bmim][PF₆] na Obr. 4.24) jsou organické soli, za normálních teplot kapalné, s vysokým bodem rozkladu (cca 300 °C a výše) a prakticky neměřitelnou tenzí par.

Díky této vlastnosti se záhy staly předmětem zájmu organických chemiků, neboť mohou sloužit jako reakční média a rozpouštědla pro syntézy a extrakce, která jsou šetrná k životnímu prostředí. Po syntéze či extrakci do IL lze k její recyklaci použit nadkritický CO₂, u kterého lze „ladit“ vnějšími podmínkami (tlak, teplota) jeho rozpouštěcí schopnosti a tím dosáhnout selektivní extrakce.

Pro měření rozdělovacích koeficientů je třeba připravit otevřenou kapilární kolonu se stacionární fází z IL. Náplňové kolony nejsou vhodné pro značný tlakový spád, který vnáší do měření chybu a pro významnou sorpci polárnějších analytů na aktivních centrech nosiče, takže hrozí, že změřená retence neodráží pouze distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.

Pro měření je třeba znát přesné množství stacionární fáze v systému – prakticky jediný způsob přípravy kolony je statické smáčení.

Závěr

SFC prošla v posledních 10 letech zásadním vývojem. Přestože byla původně využívána mobilní fáze v čistě nadkritickém stavu, moderní pojetí SFC běžně používá binární mobilní fázi, která je ve stavu spíše subkritickém. Výhodné chromatografické vlastnosti jsou zde přesto zachovány, jelikož hlavní složkou mobilní fáze zůstává CO₂, jež má vysokou difuzivitu a nízkou viskozitu i bod kritickým bodem. Použití mobilní fáze se zvýšenou difuzivitou se obecně projeví zkrácením doby analýz. Nižší viskozita mobilní fáze dovoluje separovat při nižších tlacích a používat náplňové kolony plněné sorbenty s menší zrnitostí, které poskytnou lepší separaci. Mezi výhody SFC patří vysoká rychlost analýz, vysoká separační účinnost, originální selektivita, a také větší šetrnost k životnímu prostředí. Moderní přístroje pro preparativní SFC navíc umožňují použitý CO₂ efektivně recyklovat.

Těžiště současných SFC aplikací leží především v separacích lipofilních látek, farmaceutických aplikacích a v preparativní SFC. Nezanedbatelná úspora času a v některých případech až řádová úspora organických rozpouštědel z ní dělá jasného favorita pro farmaceutický průmysl. Mezi aplikační odvětví SFC dále patří především chirální separace a analýza lipofilních látek jako jsou například lipidy, lipofilní vitamíny, karotenoidy a další. Použitím organického modifikátoru, případně aditiv, se však SFC úspěšně rozšířila také do dopingové analýzy, analýzy potravin, bioanalýzy a mnoha dalších.

Své místo má SFC také v dělení směsí, které vyžadují vysoké teploty pro eluci v GC a hrozí riziko rozkladu analytů. SFC-FID je vhodná pro látky, které postrádají chromoforní skupiny a jsou obtížně detekovatelné v HPLC. Tato letitá výhoda však díky ceně a dostupnosti MS detektorů pomalu ustupuje do pozadí.