LABOREXPO 2022: HPLC a MS pro robustní analýzu biomolekul: Agilent 1290 Infinity II Bio/6545XT QTOF

Nástroje Agilent pro analýzu biologických léčiv

Příprava vzorku -> Separace -> Detekce -> Vyhodnocení dat a reporty

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC 1300 bar
• Agilent 1260 Infinity II BioInert LC 600 bar
• Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System

Agilent AdvanceBio LC Columns

• Kolony pro intaktní proteiny, mapování peptidů, analýzu oligonukleotidů

• PLRP-S 1000 Å

• AdvanceBio RP mAb

• Zorbax SB 300 RRHD

• Poroshell 300

• AdvanceBio Peptide Mapping

• AdvanceBio Peptide Plus

• AdvanceBio Oligonucleotides

Bioinertní a Biokompatibilní

• Nutnost/potřeba BIO instrumentace v laboratoři

BIO:

• Materiály v dráze toku vzorku neobsahují žádné železo, pouze velmi ušlechtilé materiály

BIO INERT:

• Materiály v dráze toku vzorku neobsahují žádné kovy

HPST: Bioinertní a Biokompatibilní

Proč je to nutné?

• Chování některých biomolekul

  • Chelatace – interakce biomolekuly se železem
  • Oxidace, Sorpce

• Bio aplikace vyžadují náročné chemické požadavky

  • Vysoká koncentrace solí
  • Vysoké nebo nízké pH

“určitě nechceme rezavý standardní HPLC”

• Foto-degradace (vysoká světelná intenzita)
  • Agilent řešení: “Max Light Cartridge LSS DAD průtočná cela” s neutrálním šedým filtrem !

Co je to MP35N?

• MP35N je slitina (Ni-Co-Cr-Mo → 35%, 35%, 20%, 10%)
• Odbornou veřejností akceptovaný bio-kompatibilní materiál pro UHPLC

HPST: Co je to MP35N

Corrosion Resistance

MP35N alloy possesses ecxcellent resistence to sulfidation, high temperature oxidation, hydrogen embrittlement, saline solutions and most mineral acids.

• Nitric Acid/Good
• Phosphoric Acid/Good
• Sodium Hydroxide/Good
• Sea Water/Excellent
• Humidity/Excellent
• Sulfuric Acid/Good
• Acetic Acid/ Excellent
• Salt Spray (NaCl)/ Excellent
• Sour Oil/Gas/ Excellent

Type Analysis

• Carbon (Maximum)/0.03 %
• Phosphorus (Maximum)/0.015 %
• Silicon (Maximum)/0.15 %
• NIckel/33.00 to 37.00 %
• Cobalt/Balance
• Boron/0.010 %
• Manganese (Maximum)/0.15 %
• Sulfur (Maximum)/0.010 %
• Chromium/19.00 to 21.00 %
• Molybdenium/9.00 to 10.50 %
• Titanium (Maximum)/1.00 %
• Iron (Maximum)/1.00 %

Agilent 1290 Infinity II Bio LC

Čerpadla

• binární a kvartérní gradient do 1300 bar

Autosampler

• multisampler s možností multi-wash (oplach jehly až 3 rozpouštědly, min. carryover)

Termostat kolon

• nové termo-ekvilibrační příslušenství
• nové bio ventily (2pos/10port)

Detektory

• nové 2 bio průtočné cely pro VWD detektor
• nová Hi-Sensitivity průtočná cela s clonou/filtrem pro DAD detektor

HPST: Agilent 1290 Infinity II Bio LC Pumpy

Analýza oligonukleotidů na standardním HPLC systému

Fosforylované sloučeniny (AMP, ADP, ATP)

• chromatografická výzva pro standardní HPLC systémy (SST průtočné cesty)
• nežádoucí interakce fosfátových skupin s povrchem průtočných cest
• chvostování píků a špatná reprodukovatelnost

Pasivace systému

• inaktivace polárních povrchových skupin a redukce množství kovů elujícího ze standardního HPLC systému
• časově a finančně náročná operace

Málo adsorpční systémy Agilent

• BIO INERTNÍ nebo BIO KOMPATIBILNÍ HPLC

Standardní HPLC versus BIO HPLC

HPST: Standardní HPLC versus BIO HPLC

Fotodegradace

• DAD lampa off
• DAD lampa on
• DAD lampa s clonou/filtrem

HPST: Fotodegradace

Příprava vzorku -> Separace -> Detekce -> Vyhodnocení dat a reporty

6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

• Intaktní proteiny: vynikající citlivost a kvalita spekter
• Mapování peptidů: rutinní konfirmace nebo hlubší charakterizace pomocí Iteratiního MS/MS
• Profilování glykanů: plný workflow v Bioconfirm SW

Altium: Agilent 6545XT AdvanceBio LC-Q-TOF Quadrupole Time of Flight System

6545XT dedikovaný LC/Q-TOF pro biomolekuly

• Ultra nízké vakuum 10E¯⁸ Torr pro minimální kolize a maximální transmisi velkých molekul
• Vynikající kvalita měření pro intaktní (velké) proteiny, i malé peptidy nebo glykany
• SWARM autotune: více módů optimalizace pro velké molekuly NEBO peptidy
• Hmotnostní rozsah do m/z 30k
• MS rozlišovací schopnost 50 000 díky lepší iontové optice
• Čistění vstupní optiky bez zavzdušnění

Ladící algoritmus SWARM optimalizovaný pro velké molekuly

Altium: Ladící algoritmus SWARM optimalizovaný pro velké molekuly

Citlivost: Trastuzumab

HPST: Citlivost Trastuzumab

Přesnost hmoty a detekce izoforem po dekonovoluci

• Analýza intaktní mAb NIST (0.5 µg nástřik)
• Nábojová dekonvoluce Maximum Entropy
• Vysoká kvalita spekter umožňuje vynikající přesnost hmoty glykoforem a detekci minoritních izoforem

Altium: Analýza intaktní mAb NIST (0.5 μg nástřik)

Iterativní MS/MS – když potřebujete jít hlouběji do vzorku

• Technický článek: Highly Confident Peptide Mapping of Protein Digests Using Agilent LC/Q-TOFs

Příprava vzorku -> Separace -> Detekce -> Vyhodnocení dat a reporty

• MassHunter BioConfirm - Vše v jednom pro vyhodnocení dat

HPST: Vyhodnocení dat

Zobrazení pro intaktní proteiny

HPST: Zobrazení pro intaktní proteiny

Zobrazení pro mapování peptidů

HPST: Zobrazení pro mapování peptidů

Příprava vzorku -> Separace -> Detekce -> Vyhodnocení dat a reporty

HPST: Shrnutí

Příprava vzorku

• Agilent AssayMAP Bravo

Separace

• BioInertní (600 bar)
• BioCompatibilní (1300 bar)
• Modulární HPLC

Detekce

• 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Analýza dat

• MassHunter BioConfirm