Urychlete vývoj HPLC metody o 30 % (záznam CZ webináře)
Urychlete vývoj HPLC metody o 30 % (záznam CZ webináře)
Jak má vypadat dobrá analytická metoda? Je jednoduchá, rychlá, robustní? Jde nám o citlivost nebo rozlišení píků? A může mít analytická chromatografická metoda vůbec všechny tyto atributy dohromady? Pokud ano, jak se postavit k jejímu efektivnímu vývoji a uspět? Lze vývoj metody urychlit?
Vývoji LC metody sluší systematičnost
Parametrů, které ovlivňují chromatografickou retenci a separaci je celá řada – od výběru stacionární a mobilní fáze a jejího průtoku, pH, teploty, přes použití aditiv, tvaru a strmosti gradientu až po výběr vhodné detekce píků. Zkušený analytik sice může na základě vlastností analytů a dlouholeté praxe sáhnout „na první dobrou“ po vhodné koloně i vyhovujících podmínkách, ale na mnoha pracovištích je potřeba mít výběr podmínek doložen a opodstatněn. Čím podrobněji se navíc prozkoumají při samotném vývoji metody vlivy různých faktorů, tím snáze se může posuzovat robustnost metody. Robustní metoda způsobí méně problémů při jejím dalším působení v rutinním provozu. Proto existují systematické přístupy, které jsou opakem intuitivního přístupu výše popsaného zkušeného analytika, a které pokrývají vliv všech zvolených faktorů a jejich kombinací:
Full Factorial Approach – testuje se každá kombinace faktorů – stacionární fáze, organické rozpouštědlo, pH mobilní fáze. Poskytuje ucelený obrázek, ale je to zdlouhavý přístup, vyžaduje časté přepínání kolon a změnu mobilních fází
AQbD (Analytical Quality by Design) – je založen na softwaru, který navrhne potřebné experimenty a po jejich provedení vyhodnotí nejrobustnější prostor podmínek pro vývoj dané metody. Pracuje jen s jednou stacionární fází v daný moment
Systematický protokol – je alternativou, kde jsou vyváženy jak rychlost vývoje metody, tak i množství prohledaných podmínek pro výslednou robustnost metody.
Waters: Přístupy k vývoji LC metody
Než začneme s vývojem metody…
Tip 1: Je váš LC systém v dobré kondici? Ujistěte se proměřením vašeho referenčního standardu, že vše chodí jak má
Tip 2: Vždy vyberte průměr kolony s ohledem na disperzi vašeho LC
Waters: Píky s větším objemem píku než je samotná disperze stroje budou k disperzi méně náchylné
Tip 3: I jednoduchý hmotnostní detektor (Acquity QDa) usnadní identifikaci píku a potvrzení jejich elučního pořadí ve směsném vzorku a výrazně tak může urychlit vývoj metody
Systematický protokol pro vývoj LC metody
1. Definice cílů a kritérií pro budoucí metodu
Maximální počet separovaných píků. Rozlišení píků ≥2. Symetrie píků 0.8-1.5. Kapacitní faktor ≥ 2. To vše mohou být požadavky na budoucí LC metodu a tedy cíle jejího vývoje. Kromě kritérií definujeme také povahu vzorku a chromatografický systém, který má být použit.
2. Rychlý průzkum retence na reverzních fázích
Tento krok poslouží k rychlému vyhodnocení vhodného separačního módu a volbě vhodné pH oblasti. Testuje se retence analytů při kyselém (kys. mravenčí) a bazickém (hydroxid amonný) pH při použití běžného ACN gradientu (5-90% ACN). Vhodným sorbentem je tedy C18 fáze na hybridních částicích, které vydrží vysoké i nízké pH.
V tomto kroku jde především o retenci než separaci. Pokud retence za zvolených podmínek na koloně není, bude nutné uvažovat o HILIC. Pokud jsou všechny analyty na koloně zadržovány, lze přejít k dalšímu vývoji metody na reverzních fázích a to tedy buď v kyselé nebo bazické oblasti pH.
CSH C18 je vhodnou fází pro počáteční scouting. Je stabilní při pH 1-11 a slabý kladný náboj na povrchu částice poskytne dobrý tvar píků i případným bazickým látkám.
3. Screening kolon
V tomto kroku se zvolí sada 4-6 kolon s odlišnou selektivitou a odzkouší se také obě mobilní fáze, s ACN nebo MeOH. Kolony můžou být různé v závislosti na analytech a na pH, které vzešlo z prvotního průzkumu. Například, pokud vyšlo lépe bazické pH, nemohu zařadit kolony na čistě silikagelových částicích. V kyselém prostředí (pH~3) je výběr širší. Kromě silikagelových částic lze použít i hybridní nabité částice nebo mixed-mód sorbenty, které v kyselém pH poskytují další retenční mechanismus.
BEH C18, HSS T3, HSS PFP, CSH Phenyl-hexyl je příklad balíčku kolon s širokou selektivitou pro screening v kyselém pH.
Waters: Screeningový protokol pro systematický vývoj LC metod
4. Optimalizace podmínek
Finálním krokem je doladění podmínek, pokud doposud zvolené parametry (kolona, pH oblast, ACN vs MeOH) nesplňují zcela vytčené cíle. V této fázi se zpravidla lehce upravuje gradient, zkouší se drobné změny pH, teploty a zvažují se případně další parametry – třeba použití aditiv do mobilní fáze. Na konci protokolu by mělo být v ideálním případě dosaženo všech vytčených cílů a splněny nároky na LC metodu. Při optimalizaci také získáme důležité informaci o robustnosti metody – třeba právě k drobným odchylkám pH, teploty a podobně.
Lze vývoj metody urychlit bez rezignace na systematičnost a důkladný screening podmínek?
Nebojte se menších částic
Vyvíjíte HPLC metodu. Jste zvyklí na 5 µm částice. Zkuste HPLC kolony s 3.5 µm! Při optimalizaci průtoku můžete dosáhnout stejné separace jako na 5 µm kolonách, ale v čase kratším o 30%.
Waters: Column Calculator pro přepočet podmínek při změně velikosti částic kolony
Zvolte vhodný kolonový hardware
Organické kyseliny, organofosfáty, oligonukleotidy, fosfolipidy a další skupiny analytů, které mají charakter Lewisovy báze nespecificky interagují s oxidy kovu na kovových površích a ulpívají na nich.
Takovým povrchem je i chromatografické kolona z nerezové oceli. Tyto interakce pak vedou ke špatnému tvaru píků, velké variabilitě výsledků a malé citlivosti. Snaha vyřešit tyto problémy pak může přímočarý vývoj metody změnit v bloudění v nepřehledném bludišti. Čas potřebný k ověřování výsledků a řešení příčin problémů prodlužuje vývoj metody.
MaxPeak High Performance Surfaces je nová a inovativní technologie přinášející zvýšení výtěžnosti, citlivosti a reprodukovatelnosti metody tím, že zamezuje nespecifickým interakcím analytů, které mohou vést ke ztrátám vzorku. MaxPeak HPS technologie přináší důvěryhodnost výsledků již od prvních nástřiků a je dalším z faktorů, které mohou vývoj metody urychlit.
Waters: Technologie MaxPeak HPS zabraňuje ulpívání analytů na nerezové LC koloně
