Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC | LabRulez LCMS

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Po, 21.3.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Vliv velikosti nástřiku na účinnost kolony

Na účinnost kolony má vliv velikost nástřiku zejména u mikrokolon. Experimentálně bylo zjištěno, že velikost nástřiku neovlivní účinnost kolony, jestliže vzorek zaujme v koloně prostor odpovídající √n/2 to znamená, že pro kolonu s n = 1000 může zaujmou asi 16 pater a 1,6 % její délky, pro kolonu s n = 5000 asi 35 pater, ale jen 0,7 % její délky.

Exaktně vyjádřeno je maximálně použitelný objem dávkovaného vzorku VI závislý na účinnosti chromatografického systému vyjádřený počtem teoretických pater n a na retenčním objemu VR:

HPLC.cz: Výpočet velikosti objemu nástřiku

kde a je konstanta vyjadřující rozmytí píku. Nemá-li rozmytí dosáhnout 10 % je a = 1,1, pak vyjádřením mimokolonového příspěvku nástřiku vzorku k rozšíření zóny (vzhledem k aditivitě jednotlivých příspěvků k rozmytí eluční zóny dostaneme):

HPLC.cz: Výpočet velikosti objemu nástřiku

kde svI² je rozptyl objemového rozmytí způsobeného objemem dávkovaného vzorku.

Při použití mikrokolony s vnitřním průměrem 1 mm, délkou 150 mm a sorbentem s částicemi o velikosti 5 µm by dávkovaný objem neměl přesáhnout 0,84 µl, při použití kolony s vnitřním průměrem 0,5 mm a délkou 100 mm se tento objem snižuje na 0,17 µl a při zkrácení kolony na 20 mm je pak maximálně dávkovaný objem 0,08 µl.

Tento objem je technicky nemožné dávkovat na mikrokolonu a vzniká tedy paradox mezi objemem dávkovaného vzorku a malým retenčním objemem.

Na mikrokolonu se dávkuje vzorek o objemu VI, který přesahuje daleko retenční objem VR a v tomto případě můžeme na proces dávkování hledět jako na chromatografii se stupňovitým gradientem síly mobilní fáze - významnou roli zde totiž hraje retenční síla solventu vzorku, která je charakterizována kapacitním poměrem solutu v solventu vzorku kS. V tomto případě musí platit, že kapacitní poměr kS >> k, kde k je kapacitní poměr solutu v mobilní fázi a pak platí pro retenční objem:

VR = VI + kVM

ze kterého je zřejmé, že je na mikrokolonu možné dávkovat vzorek o objemu několikanásobně převyšující mrtvý objem kolony. V případě, že kS = k, pak velikost VI je omezena pouze rovnicí.

Pro velikost objemu nástřiku VI vyhovuje velmi dobře vztah:

HPLC.cz: Výpočet velikosti objemu nástřiku

Máme-li kolonu o vnitřním průměru 4,6 mm a kapacitní poměr k = 5, účinnost kolony je n = 10 000, pak objem nástřiku VI by měl zaujmout maximálně 289 pater tj. 2,9 % délky kolony. Pro kolonu o délce L = 250 mm to pak odpovídá asi nástřiku 120 µl, ale pro kolonu o délce L = 100 mm pouze 50 µl aniž by došlo k ovlivnění účinnosti separace.

Vliv objemu nástřiku na selektivitu systému a retenci je (popsán zde).

Mimokolonové příspěvky k rozšíření chromatografické zóny

K rozšíření chromatografické zóny přispívají nemalou měrou i mimokolonové příspěvky. Ty představují rozšíření chromatografických píků v nastřikovacím zařízení, spojovacích zařízení (potrubí, spojky) a detektoru. Na reverzní fázi hraje velkou úlohu k rozšíření chromatografické zóny zbytková koncentrace silanolových skupin.

Tento příspěvek je úměrný celkovému objemu těchto částí. Rozptyl v šířce chromatografické zóny je tedy roven součtu rozptylů v koloně a ve všech ostatních objemových částech chromatografického systému a matematicky můžeme psát:

HPLC.cz: Výpočet rozptylu v šířce chromatografické zóny

Objemy všech částí aparatury mají být tedy co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.

Toto je zejména markantní u použití mikrokolon (krátké a extrémně úzké, plněné malými částečkami), kdy klesá volný objem kolony jejím zkrácením a zmenší se i výškový ekvivalent teoretického patra.

Nástřik vzorku a objem cely detektoru

Pro odhad směrodatné odchylky příspěvku objemu nástřiku Vi, použijeme-li varianci obdélníkového koncentračního pulsu, můžeme psát:

HPLC.cz: Výpočet příspěvku objemu nástřiku Vi

a pro objemový příspěvek detektoru Vdet můžeme napsat stejnou rovnici:

HPLC.cz: Výpočet příspěvku detektoru Vdet

Mimokolonový příspěvek objemu nástřiku a objemu cely detektoru se sníží objemovým snížením těchto parametrů.

Spoje

Spojovací kapiláry mezi kolonou a detektorem, kolonou a nástřikovým zařízením musí být voleny tak, aby zbytečně nezvyšovaly mrtvý objem celého chromatografického systému a tím nepřispívaly k rozmývání elučních křivek. Rozšiřování píků v kapilárních spojích je možné vyjádřit rozptylem Taylor-Arisovou rovnicí:

HPLC.cz: Výpočet příspěvku kapilárních spojů

kde L je délka kapiláry, dt je její vnitřní průměr.(1),(2) Pro mimokolonové příspěvky je nutné, aby kapiláry byly co nejkratší a měly co nejmenší vnitřní průměr, ale v praxi se nemůže omezeně zmenšovat jejich vnitřní průměr pro značný vzrůst odporu (0,08-0,25 mm).

Vliv spojovacího potrubí lze demonstrovat tím, že při průchodu mobilní fáze spojovacím potrubím (kapilárou, kolonou) dochází k deformaci zóny složky. Ve středu kapiláry postupuje mobilní fáze (a tím i zóny složky) pomaleji než u stěn kapiláry.

Výsledkem je, že směrodatná odchylka v šířce zóny je větší než očekávaná hodnota ( viz obrázek č. 1) a je rovna hodnotě B místo očekávané hodnotě A (projevuje se u kapilár s velkým vnitřním průměrem).

HPLC.cz: Obr. 1 Profil zóny složky v chromatografické koloně

Elektronika detektoru

Časová konstanta detektoru

Pro experimentální modifikovanou Gaussovu křivku je rozptyl dán součtem rozptylu symetrického Gaussova rozdělení a časové konstanty t²

HPLC.cz: Výpočet příspěvku elektroniky detektoru

Pro retenční čas 1 min a účinnost kolony n = 10 000 pater je s asi 0,6 s (kolona 3,9x150 mm Fm = 1,5 ml/min) a proto by měly mít detektory časovou konstantu < 1s, lépe okolo 0,1 s.

A/D převodník a digitální filtr

Pro časovou konstantu tA/D převodníku (filtr) můžeme vyjít z rovnice pro nástřik vzorku a substitucí dostaneme:

HPLC.cz: Výpočet příspěvku A/D převodníku

Vliv časové konstanty detektoru je ukázán na obrázku č. 2 ze kterého je zřejmý mimokolonový příspěvek časové konstanty k rozšiřování šířky píku.

Pro digitální filtr (záměna elektronického filtru) se zavádí faktor b:

HPLC.cz: Výpočet příspěvku digitálního filtru

V případě, že b=10 a časová konstanta tA/D = 0,1 je s = 0,3 s.

Kromě elektronických konstant detektoru existuje u některých typů detektorů i možnost nastavení rychlosti sběru a ukládání dat (bodů za sekundu, SR), které má vliv na tvar elučního píku. Minimální počet bodů přes celý pík je 15 bodů a pro určení velikost SR zde platí rovnice:

HPLC.cz: Výpočet velikosti rychlosti sběru a ukládání dat (SR)

kde YV je šířka píku v základně píku (s). V případě, že šířka píku W=3 s, pak SR = 15/3 = 5 s¯¹. Pro pochopení je vliv nastavení SR ukázán na obrázku č. 3.

HPLC.cz: Obr. 2 Vliv časové konstanty detektoru (filtr) na mimokolonové rozšíření píku

HPLC.cz: Obr. 3 Vliv nastavení SR (Sampling Rate ) na tvar píku. (SR = 5,0 tj. 5 bodů za sekundu; SR = 0,25 tj. 1 bod za 4 sekundy)

Mimokolonové příspěvky, zde zejména příspěvky objemu cely detektoru, by měly dosahovat maximálně 10-30 % směrodatné odchylky, jinak rozmytí zón je pak daleko větší a uplatňují se tím daleko významněji k rozšíření chromatografického píku.

Zdroje

(1) Taylor G.I.: Proc. Roy. Soc. A219, 196 (1953)

(2) Aris R.: Proc. Roy. Soc. A235, 67 (1965)

Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Ultra fast high temperature LC (UFHTLC)

Dnešní díl tipů & triků v HPLC blíže rozebere možnosti a dopady zvýšené teploty na chromatografické koloně a techniku UFHTLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Ultra fast high temperature LC (UFHTLC)

Dnešní díl tipů & triků v HPLC blíže rozebere možnosti a dopady zvýšené teploty na chromatografické koloně a techniku UFHTLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Ultra fast high temperature LC (UFHTLC)

Dnešní díl tipů & triků v HPLC blíže rozebere možnosti a dopady zvýšené teploty na chromatografické koloně a techniku UFHTLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Ultra fast high temperature LC (UFHTLC)

Dnešní díl tipů & triků v HPLC blíže rozebere možnosti a dopady zvýšené teploty na chromatografické koloně a techniku UFHTLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.