Tipy a triky v HPLC: Regenerace analytické HPLC kolony

Reverzní fáze C4, C8, C18; Phenyl

Při současných cenách analytických kolon je nejdůležitější otázkou životnost analytické kolony tj. jak skladovat kolonu a jak kolonu popřípadě regenerovat k prodloužení její životnosti.

Uchovávání analytické kolony je popsáno v předchozím článku Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony.

K prodloužení životnosti analytické HPLC kolony s reverzní fází je vhodné řídit se následujícími doporučeními.

V pravidelných intervalech analytickou kolonu proplachovat solventem (10-20 kolonového objemu) při polovičním průtoku mobilní fáze než se používá obvykle. Jako solvent se volí nejčastěji methanol nebo acetonitril. Tímto procesem se jednak z kolony vytěsní látky a nečistoty, které za normálních podmínek neeluují vůbec nebo mají příliš velké kapacitní poměry vůbec a současně dochází k rekondicionaci stacionární fáze.

Obecná regenerace

K regeneraci kolony slouží různé "dekontaminační programy", které se volí vzhledem k předpokládaným kontaminantům. Jeden z nejjednodušších dekontaminačních programů je uveden níže:

• Voda (30 ml)
• Methanol (30 ml)
• Tetrahydrofuran (30 ml)
• Dichlormethan (30 ml)
• Tetrahydrofuran (30 ml)
• Methanol (30 ml)

Použití vody v prvním kroku je důležité vždy v případě použití pufrů jako mobilní fáze, při použití methanolu přímo může dojít k vysrážení pufrů v systému! Jako alternativu lze doporučit mobilní fázi methanol/voda (30+70 maximálně 50+50).

Použití dichlormethanu slouží k eluci lipidů a malých hydrofóbních molekul, následné použití tetrahydrofuranu a methanolu slouží k převedení kolony opět do reverzního módu.

Kontaminace proteiny

Pro dekontaminaci proteinových kontaminantů je možno použít nástřik 100-200 µl dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo 100-200 µl trifluorethanolu na kolonu do mobilní fáze se kterou jsou uvedené látky mísitelné. Tento postup se může opakovat dva- až třikrát.

Další alternativní postup: proplach kolony mobilní fází o složení 0,1M HNO3 (1+4)/isopropanol při průtoku kolem 20 % obvykle používaných průtoků přes noc.

V tomto případě je možné vyzkoušet také následující postup:

1. propláchnutí kolony vodou (asi 30 kolonovými objemy) při průtoku 1 ml/min

2. propláchnutí kolony acetonitrilem (asi 10 kolonovými objemy) při průtoku 1 ml/min

3. propláchnutí kolony mobilní fází o složení: acetonitril + tetrahydrofuran – voda – dimethylsufloxid (150 + 100 + 50 + 3) asi 100 kolonovými objemy při průtoku 1 ml/min

4. propláchnutí kolony acetonitrilem (asi 20 kolonovými objemy) při průtoku 1 ml/min a ponechat kolonu pod touto mobilní fází. S tímto postupem mám osobní zkušenosti. Při poklesu kolony z účinnosti n = 7 000 na n = 3 500 dosáhla chromatografická kolona opět původní účinnosti.

V případě, že tento postup se neosvědčí, pak je ještě možné obrátit kolonu proti toku mobilní fáze a při průtoku mobilní fáze 0,1 ml/min opakovat celou proceduru.

Kontaminace lipidy

Pro dekontaminaci lipidů je možné použít následující postup: propláchnutí kolony mobilní fází voda + isopropanol (50+50), poté propláchnutí čistým isopropanolem a nakonec dichlormethanem a to asi 50 kolonovými objemy. Poté se kolona musí uvést opět do reverzního módu propláchnutím mobilními fázemi v opačném pořadí.

Poslední krok

V případě, že předchozí procedury se neosvědčily může se vyzkoušet následující postup: připraví se roztok 6M guanidinu hydrochloridu ve vodě a tento roztok se filtruje přes sintr S4. Připraví se roztok smísením tohoto roztoku s isopropanolem (1+1) a na kolonu se nanese 250 µl tohoto roztoku při použití mobilní fáze isopropanol/voda (1+1).

Vzhledem k vlastnostem stacionární fáze dochází k „zadržování“ kontaminantů na počátku kolony. Posledním krokem proto může být otočení kolony proti obvyklému směru toku mobilní fáze a použití některých z dekontaminačních programů. Po ukončení regenerace kolony se kolona ponechá již v tomto módu (otočená).

K prodloužení životnosti analytické kolony je nejlepší způsob předcházet znečištění kolony kontaminanty a proto je vhodné vždy používat rozpouštědla čistoty HPLC a věnovat zvýšenou pozornost přípravě mobilní fáze i vzorku (zařadit purifikační kroky do přípravy roztoku vzorku)!