Regenerace analytické HPLC kolony | LabRulez LCMS

Tipy a triky v HPLC: Regenerace analytické HPLC kolony

St, 9.3.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Ve většině případu neexistuje univerzální postup regenerace chromatografické kolony. Existují však obecně doporučované postupy její regenerace.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Regenerace analytické HPLC kolony

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Regenerace analytické HPLC kolony

Reverzní fáze C4, C8, C18; Phenyl

Při současných cenách analytických kolon je nejdůležitější otázkou životnost analytické kolony tj. jak skladovat kolonu a jak kolonu popřípadě regenerovat k prodloužení její životnosti.

Uchovávání analytické kolony je popsáno v předchozím článku Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony.

K prodloužení životnosti analytické HPLC kolony s reverzní fází je vhodné řídit se následujícími doporučeními.

V pravidelných intervalech analytickou kolonu proplachovat solventem (10-20 kolonového objemu) při polovičním průtoku mobilní fáze než se používá obvykle. Jako solvent se volí nejčastěji methanol nebo acetonitril. Tímto procesem se jednak z kolony vytěsní látky a nečistoty, které za normálních podmínek neeluují vůbec nebo mají příliš velké kapacitní poměry vůbec a současně dochází k rekondicionaci stacionární fáze.

Obecná regenerace

K regeneraci kolony slouží různé "dekontaminační programy", které se volí vzhledem k předpokládaným kontaminantům. Jeden z nejjednodušších dekontaminačních programů je uveden níže:

  • Voda (30 ml)
  • Methanol (30 ml)
  • Tetrahydrofuran (30 ml)
  • Dichlormethan (30 ml)
  • Tetrahydrofuran (30 ml)
  • Methanol (30 ml)

Použití vody v prvním kroku je důležité vždy v případě použití pufrů jako mobilní fáze, při použití methanolu přímo může dojít k vysrážení pufrů v systému! Jako alternativu lze doporučit mobilní fázi methanol/voda (30+70 maximálně 50+50).

Použití dichlormethanu slouží k eluci lipidů a malých hydrofóbních molekul, následné použití tetrahydrofuranu a methanolu slouží k převedení kolony opět do reverzního módu.

Kontaminace proteiny

Pro dekontaminaci proteinových kontaminantů je možno použít nástřik 100-200 µl dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo 100-200 µl trifluorethanolu na kolonu do mobilní fáze se kterou jsou uvedené látky mísitelné. Tento postup se může opakovat dva- až třikrát.

Další alternativní postup: proplach kolony mobilní fází o složení 0,1M HNO3 (1+4)/isopropanol při průtoku kolem 20 % obvykle používaných průtoků přes noc.

V tomto případě je možné vyzkoušet také následující postup:

1. propláchnutí kolony vodou (asi 30 kolonovými objemy) při průtoku 1 ml/min

2. propláchnutí kolony acetonitrilem (asi 10 kolonovými objemy) při průtoku 1 ml/min

3. propláchnutí kolony mobilní fází o složení: acetonitril + tetrahydrofuran – voda – dimethylsufloxid (150 + 100 + 50 + 3) asi 100 kolonovými objemy při průtoku 1 ml/min

4. propláchnutí kolony acetonitrilem (asi 20 kolonovými objemy) při průtoku 1 ml/min a ponechat kolonu pod touto mobilní fází. S tímto postupem mám osobní zkušenosti. Při poklesu kolony z účinnosti n = 7 000 na n = 3 500 dosáhla chromatografická kolona opět původní účinnosti.

V případě, že tento postup se neosvědčí, pak je ještě možné obrátit kolonu proti toku mobilní fáze a při průtoku mobilní fáze 0,1 ml/min opakovat celou proceduru.

Kontaminace lipidy

Pro dekontaminaci lipidů je možné použít následující postup: propláchnutí kolony mobilní fází voda + isopropanol (50+50), poté propláchnutí čistým isopropanolem a nakonec dichlormethanem a to asi 50 kolonovými objemy. Poté se kolona musí uvést opět do reverzního módu propláchnutím mobilními fázemi v opačném pořadí.

Poslední krok

V případě, že předchozí procedury se neosvědčily může se vyzkoušet následující postup: připraví se roztok 6M guanidinu hydrochloridu ve vodě a tento roztok se filtruje přes sintr S4. Připraví se roztok smísením tohoto roztoku s isopropanolem (1+1) a na kolonu se nanese 250 µl tohoto roztoku při použití mobilní fáze isopropanol/voda (1+1).

Vzhledem k vlastnostem stacionární fáze dochází k „zadržování“ kontaminantů na počátku kolony. Posledním krokem proto může být otočení kolony proti obvyklému směru toku mobilní fáze a použití některých z dekontaminačních programů. Po ukončení regenerace kolony se kolona ponechá již v tomto módu (otočená).

K prodloužení životnosti analytické kolony je nejlepší způsob předcházet znečištění kolony kontaminanty a proto je vhodné vždy používat rozpouštědla čistoty HPLC a věnovat zvýšenou pozornost přípravě mobilní fáze i vzorku (zařadit purifikační kroky do přípravy roztoku vzorku)!

Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Mrtvý objem kolony, systému a použití mixeru mobilní fáze v HPLC

V dalším díle Tipů a Triků v HPLC zjistíme, kdy je dobré vědět, jaký mrtvý objem má Vaše kolona nebo systém a jak postupovat při výběru statického mixeru mobilní fáze.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Optimalizace extrakce tuhá látka-kapalina a úprava extraktu v HPLC

Dnešní díl Tipů a Triků v HPLC přináší náhled a doporučení pro přípravu vzorků extrakcí tuhá látka-kapalina, jejich SPE přečištění a případnou optimalizaci chromatografických podmínek.
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Mrtvý objem kolony, systému a použití mixeru mobilní fáze v HPLC

V dalším díle Tipů a Triků v HPLC zjistíme, kdy je dobré vědět, jaký mrtvý objem má Vaše kolona nebo systém a jak postupovat při výběru statického mixeru mobilní fáze.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Optimalizace extrakce tuhá látka-kapalina a úprava extraktu v HPLC

Dnešní díl Tipů a Triků v HPLC přináší náhled a doporučení pro přípravu vzorků extrakcí tuhá látka-kapalina, jejich SPE přečištění a případnou optimalizaci chromatografických podmínek.
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Mrtvý objem kolony, systému a použití mixeru mobilní fáze v HPLC

V dalším díle Tipů a Triků v HPLC zjistíme, kdy je dobré vědět, jaký mrtvý objem má Vaše kolona nebo systém a jak postupovat při výběru statického mixeru mobilní fáze.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Optimalizace extrakce tuhá látka-kapalina a úprava extraktu v HPLC

Dnešní díl Tipů a Triků v HPLC přináší náhled a doporučení pro přípravu vzorků extrakcí tuhá látka-kapalina, jejich SPE přečištění a případnou optimalizaci chromatografických podmínek.
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Mrtvý objem kolony, systému a použití mixeru mobilní fáze v HPLC

V dalším díle Tipů a Triků v HPLC zjistíme, kdy je dobré vědět, jaký mrtvý objem má Vaše kolona nebo systém a jak postupovat při výběru statického mixeru mobilní fáze.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Optimalizace extrakce tuhá látka-kapalina a úprava extraktu v HPLC

Dnešní díl Tipů a Triků v HPLC přináší náhled a doporučení pro přípravu vzorků extrakcí tuhá látka-kapalina, jejich SPE přečištění a případnou optimalizaci chromatografických podmínek.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.