LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
Česká chromatografická škola
Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání.
Tagy
Článek
Akademie
Logo of LinkedIn

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Čt, 6.1.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Reverzní fáze (C4, C8, C12 a C18)

Níže jsou uvedeny typické hodnoty průtoku mobilní fáze (pro kolonu délky 25 cm).

Typ kolony Microbore
  • Vnitřní průměr kolony: 1.0 mm
  • Průtok: 0.025 - 0.05 ml/min
  • Maximum vzorku: 10 mg
Typ kolony Narrowbore
  • Vnitřní průměr kolony: 2.1 mm
  • Průtok: 0.1 – 0.3 ml/min
  • Maximum vzorku: 50 mg
Typ kolony Analytická
  • Vnitřní průměr kolony: 4.6 mm
  • Průtok: 0.5 - 1.5 ml/min
  • Maximum vzorku: 200 mg

Kapacita analytické kolony je vyjádřena jako maximální množství vzorku, která je daná kolona schopna ještě separovat (kolona pracuje v lineární oblasti absorpční isotermy). Vliv absorpční isotermy na tvar píku a retenci solutu je patrný z obrázku:

HPLC.cz: Absorpční isoterma

Kapacita pro každý vzorek závisí na mnoha faktorech – složení mobilní fáze, složení samotného vzorku atd. Na chromatogramu je ukázána separace dvou látek, kde byly překročena kapacita analytické kolony.

HPLC.cz: Kapacita analytické kolony

Mobilní fáze - pufry

Při přípravě mobilní fáze se často používají aditiva, která slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze. Při přípravě pufrovaných mobilních fází je vhodné pracovat v oblasti pK daného pufru, kdy se dosahuje nejvyšší pufrovací kapacity. Pufrovací kapacita (b) kvantitativně vyjadřuje jak se změní pH pufru při přídavku malého množství kyseliny nebo báze. (1)

Nebudeme-li uvažovat dále ve výpočtech aktivitní koeficienty pak můžeme pro matematické vyjádření pufrační kapacity napsat:

b = d(Cb) / d(pH)

kde d(Cb) představuje malý přídavek báze a d(pH) je výsledná změna pH. Podle této definice je tudíž pufrační kapacita reciprokou hodnotou směrnice titrační křivky.

Pro pufrační kapacitu lze dovodit následující rovnici. Pufrační kapacita slabé kyseliny závisí na poměru koncentrací (H⁺) a pKₐ a na koncentraci pufru (cHA). Maximální pufrační kapacity se dosáhne když pH je rovno pKₐ:

bmax = 0,58cHA

V případě změny ± 1 jednotky pH od pKₐ je pufrační kapacita 0,19 cHA, v případě změny ± 2 jednotek pH od pKₐ je pak pufrační kapacita již 25krát nižší než bmax.

Při přípravě pufrovaných mobilních fází se většinou upravuje pH mobilní fáze a to s přesností na 0,1 jednotky pH, protože i malá změna pH mobilní fáze může vést ke změně retence analytu. pH mobilní fáze se většinou měří a upravuje před přídavkem organického rozpouštědla, protože pH v organických rozpouštědlech se výrazně liší od pH vodných rozpouštědel.

Pro autoprotolytickou konstantu vody platí KH₂O = (H⁺)·(OH⁻) = 10⁻¹⁴, pro autoprotolytickou konstantu methanolu však platí KMeOH = (H⁺)·(CH₃O⁻) = 10⁻¹⁶ᶦ⁶. To znamená, že pro koncentraci (H⁺) = (CH₃O⁻) = 10⁻⁸ᶦ³ (nebo pH 8,3) je prostředí neutrální.

Ve směsném rozpouštědle methanol – voda pak autoprotolytická konstanta leží mezi 10⁻¹⁴ až 10⁻¹⁶ᶦ⁶, protože vedle sebe vystupují anionty H⁺, CH₃O⁻ a OH⁻. Methoxidový anion má vyšší nukleofilitu oproti OH⁻ a proto pufry připravené v prostředí methanol – voda mají rozdílné vlastnosti proti čistě vodným pufrům.

Pro změnu pH pufrů v nevodných prostředích můžeme odvodit obecná pravidla. Pro slabé kyseliny (kyselina octová, H₂PO₄⁻) v pKa stoupá, pro slabé zásady (NH₄⁺) naopak pKₐ klesá. (2)

HPLC.cz: Tabulka pKₐ pufrů ve vodě a rozpouštědle methanol-voda (50 + 50)

Příprava mobilních fází

Při přípravě pufrovaných mobilních fází můžeme postupovat několikerým způsobem.

  • Jedním ze způsobů je ten, že se pro vypočtenou koncentraci a pH pufru se smíchá požadované množství kyseliny a báze a doplní vodou na definovaný objem (např. roztok hydroxidu sodného a kyseliny octové). Chyba pH takto připraveného pufr se pohybuje kolem 0,1 jednotky pH, protože nepočítáme s aktivitními koeficienty.

  • Druhý způsob přípravy spočívá v tom, že se připraví přesná koncentrace kyseliny resp. báze a přidá se menší množství báze resp. kyseliny než odpovídá požadovanému (vypočtenému) množství. pH takto připraveného pufru se pak upravuje pod pH metrem bazí nebo kyselinou na požadované pH pufru.

  • Třetí způsob přípravy pufrovaných mobilních fází se příliš obecně nedoporučuje a používá se pouze v případech, kdy velmi malá změna pH má vliv na retenci solutu. Tento způsob upřednostňuje úpravu pH mobilní fáze až po smísení s organickou složkou mobilní fáze.

Výhodou prvního způsobu je rychlá příprava mobilní fáze, druhý způsob je vhodný pro přípravu mobilních fází s přesně definovaným pH mobilní fáze.

Odkazy

Další edukativní příspěvky od Česká chromatografická škola naleznete na jejich profilu.
Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí

An advanced integrated GC-MS/MS and LC-MS/MS workflow for the comprehensive analysis of pesticide residues in food

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články


Článek | Webináře

Altium webinář: Agilent LC Solutions For Food Testing and Food Fortification

HPLC je výkonná analytická technika široce používaná v potravinářství, průmyslu, výzkumných a komerčních laboratořích pro kontrolu kvality, hodnocení bezpečnosti a nutriční analýzy.
Altium International
more

Článek | Produkt

Nový systém čištění vody ELGA Purelab Flex

ELGA PURELAB Flex - nejnovější generace systémů čištění vody pro širokou škálu aplikací. Více flexibility s výrazně sníženým dopadem na životní prostředí.
Česká voda – MEMSEP, a.s.
more

Článek | Produkt

EnviroMail™17/Evropa: Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Zemědělské hospodaření znečišťuje půdu a vody pesticidy. Řešením jsou in-situ denitrifikační bioreaktory.
ALS Czech Republic
more

Článek | Nejbližší akce

LABOREXPO & PROCESEXPO 2024 (doprovodný odborný program)

Hlavní částí doprovodného programu veletrhu bude dvoudenní program odborných a produktových prezentací, které představí konkrétní aplikace, novinky a trendy v laboratorní a analytické technice.
LabRulez
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí

An advanced integrated GC-MS/MS and LC-MS/MS workflow for the comprehensive analysis of pesticide residues in food

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články


Článek | Webináře

Altium webinář: Agilent LC Solutions For Food Testing and Food Fortification

HPLC je výkonná analytická technika široce používaná v potravinářství, průmyslu, výzkumných a komerčních laboratořích pro kontrolu kvality, hodnocení bezpečnosti a nutriční analýzy.
Altium International
more

Článek | Produkt

Nový systém čištění vody ELGA Purelab Flex

ELGA PURELAB Flex - nejnovější generace systémů čištění vody pro širokou škálu aplikací. Více flexibility s výrazně sníženým dopadem na životní prostředí.
Česká voda – MEMSEP, a.s.
more

Článek | Produkt

EnviroMail™17/Evropa: Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Zemědělské hospodaření znečišťuje půdu a vody pesticidy. Řešením jsou in-situ denitrifikační bioreaktory.
ALS Czech Republic
more

Článek | Nejbližší akce

LABOREXPO & PROCESEXPO 2024 (doprovodný odborný program)

Hlavní částí doprovodného programu veletrhu bude dvoudenní program odborných a produktových prezentací, které představí konkrétní aplikace, novinky a trendy v laboratorní a analytické technice.
LabRulez
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí

An advanced integrated GC-MS/MS and LC-MS/MS workflow for the comprehensive analysis of pesticide residues in food

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články


Článek | Webináře

Altium webinář: Agilent LC Solutions For Food Testing and Food Fortification

HPLC je výkonná analytická technika široce používaná v potravinářství, průmyslu, výzkumných a komerčních laboratořích pro kontrolu kvality, hodnocení bezpečnosti a nutriční analýzy.
Altium International
more

Článek | Produkt

Nový systém čištění vody ELGA Purelab Flex

ELGA PURELAB Flex - nejnovější generace systémů čištění vody pro širokou škálu aplikací. Více flexibility s výrazně sníženým dopadem na životní prostředí.
Česká voda – MEMSEP, a.s.
more

Článek | Produkt

EnviroMail™17/Evropa: Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Zemědělské hospodaření znečišťuje půdu a vody pesticidy. Řešením jsou in-situ denitrifikační bioreaktory.
ALS Czech Republic
more

Článek | Nejbližší akce

LABOREXPO & PROCESEXPO 2024 (doprovodný odborný program)

Hlavní částí doprovodného programu veletrhu bude dvoudenní program odborných a produktových prezentací, které představí konkrétní aplikace, novinky a trendy v laboratorní a analytické technice.
LabRulez
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí

An advanced integrated GC-MS/MS and LC-MS/MS workflow for the comprehensive analysis of pesticide residues in food

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články


Článek | Webináře

Altium webinář: Agilent LC Solutions For Food Testing and Food Fortification

HPLC je výkonná analytická technika široce používaná v potravinářství, průmyslu, výzkumných a komerčních laboratořích pro kontrolu kvality, hodnocení bezpečnosti a nutriční analýzy.
Altium International
more

Článek | Produkt

Nový systém čištění vody ELGA Purelab Flex

ELGA PURELAB Flex - nejnovější generace systémů čištění vody pro širokou škálu aplikací. Více flexibility s výrazně sníženým dopadem na životní prostředí.
Česká voda – MEMSEP, a.s.
more

Článek | Produkt

EnviroMail™17/Evropa: Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Zemědělské hospodaření znečišťuje půdu a vody pesticidy. Řešením jsou in-situ denitrifikační bioreaktory.
ALS Czech Republic
more

Článek | Nejbližší akce

LABOREXPO & PROCESEXPO 2024 (doprovodný odborný program)

Hlavní částí doprovodného programu veletrhu bude dvoudenní program odborných a produktových prezentací, které představí konkrétní aplikace, novinky a trendy v laboratorní a analytické technice.
LabRulez
more
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.