Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Reverzní fáze (C4, C8, C12 a C18)

Níže jsou uvedeny typické hodnoty průtoku mobilní fáze (pro kolonu délky 25 cm).

Typ kolony Microbore

• Vnitřní průměr kolony: 1.0 mm
• Průtok: 0.025 - 0.05 ml/min
• Maximum vzorku: 10 mg

Typ kolony Narrowbore

• Vnitřní průměr kolony: 2.1 mm
• Průtok: 0.1 – 0.3 ml/min
• Maximum vzorku: 50 mg

Typ kolony Analytická

• Vnitřní průměr kolony: 4.6 mm
• Průtok: 0.5 - 1.5 ml/min
• Maximum vzorku: 200 mg

Kapacita analytické kolony je vyjádřena jako maximální množství vzorku, která je daná kolona schopna ještě separovat (kolona pracuje v lineární oblasti absorpční isotermy). Vliv absorpční isotermy na tvar píku a retenci solutu je patrný z obrázku:

HPLC.cz: Absorpční isoterma

Kapacita pro každý vzorek závisí na mnoha faktorech – složení mobilní fáze, složení samotného vzorku atd. Na chromatogramu je ukázána separace dvou látek, kde byly překročena kapacita analytické kolony.

HPLC.cz: Kapacita analytické kolony

Mobilní fáze - pufry

Při přípravě mobilní fáze se často používají aditiva, která slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze. Při přípravě pufrovaných mobilních fází je vhodné pracovat v oblasti pK daného pufru, kdy se dosahuje nejvyšší pufrovací kapacity. Pufrovací kapacita (b) kvantitativně vyjadřuje jak se změní pH pufru při přídavku malého množství kyseliny nebo báze. (1)

Nebudeme-li uvažovat dále ve výpočtech aktivitní koeficienty pak můžeme pro matematické vyjádření pufrační kapacity napsat:

b = d(Cb) / d(pH)

kde d(Cb) představuje malý přídavek báze a d(pH) je výsledná změna pH. Podle této definice je tudíž pufrační kapacita reciprokou hodnotou směrnice titrační křivky.

Pro pufrační kapacitu lze dovodit následující rovnici. Pufrační kapacita slabé kyseliny závisí na poměru koncentrací (H⁺) a pKₐ a na koncentraci pufru (cHA). Maximální pufrační kapacity se dosáhne když pH je rovno pKₐ:

bmax = 0,58cHA

V případě změny ± 1 jednotky pH od pKₐ je pufrační kapacita 0,19 cHA, v případě změny ± 2 jednotek pH od pKₐ je pak pufrační kapacita již 25krát nižší než bmax.

Při přípravě pufrovaných mobilních fází se většinou upravuje pH mobilní fáze a to s přesností na 0,1 jednotky pH, protože i malá změna pH mobilní fáze může vést ke změně retence analytu. pH mobilní fáze se většinou měří a upravuje před přídavkem organického rozpouštědla, protože pH v organických rozpouštědlech se výrazně liší od pH vodných rozpouštědel.

Pro autoprotolytickou konstantu vody platí KH₂O = (H⁺)·(OH⁻) = 10⁻¹⁴, pro autoprotolytickou konstantu methanolu však platí KMeOH = (H⁺)·(CH₃O⁻) = 10⁻¹⁶ᶦ⁶. To znamená, že pro koncentraci (H⁺) = (CH₃O⁻) = 10⁻⁸ᶦ³ (nebo pH 8,3) je prostředí neutrální.

Ve směsném rozpouštědle methanol – voda pak autoprotolytická konstanta leží mezi 10⁻¹⁴ až 10⁻¹⁶ᶦ⁶, protože vedle sebe vystupují anionty H⁺, CH₃O⁻ a OH⁻. Methoxidový anion má vyšší nukleofilitu oproti OH⁻ a proto pufry připravené v prostředí methanol – voda mají rozdílné vlastnosti proti čistě vodným pufrům.

Pro změnu pH pufrů v nevodných prostředích můžeme odvodit obecná pravidla. Pro slabé kyseliny (kyselina octová, H₂PO₄⁻) v pKa stoupá, pro slabé zásady (NH₄⁺) naopak pKₐ klesá. (2)

HPLC.cz: Tabulka pKₐ pufrů ve vodě a rozpouštědle methanol-voda (50 + 50)

Příprava mobilních fází

Při přípravě pufrovaných mobilních fází můžeme postupovat několikerým způsobem.

• Jedním ze způsobů je ten, že se pro vypočtenou koncentraci a pH pufru se smíchá požadované množství kyseliny a báze a doplní vodou na definovaný objem (např. roztok hydroxidu sodného a kyseliny octové). Chyba pH takto připraveného pufr se pohybuje kolem 0,1 jednotky pH, protože nepočítáme s aktivitními koeficienty.

• Druhý způsob přípravy spočívá v tom, že se připraví přesná koncentrace kyseliny resp. báze a přidá se menší množství báze resp. kyseliny než odpovídá požadovanému (vypočtenému) množství. pH takto připraveného pufru se pak upravuje pod pH metrem bazí nebo kyselinou na požadované pH pufru.

• Třetí způsob přípravy pufrovaných mobilních fází se příliš obecně nedoporučuje a používá se pouze v případech, kdy velmi malá změna pH má vliv na retenci solutu. Tento způsob upřednostňuje úpravu pH mobilní fáze až po smísení s organickou složkou mobilní fáze.

Výhodou prvního způsobu je rychlá příprava mobilní fáze, druhý způsob je vhodný pro přípravu mobilních fází s přesně definovaným pH mobilní fáze.

Odkazy

• Obecné pokyny pro přípravu mobilních fází

• Jednoduchý kalkulátor pro výběr doporučeného pufru podle požadovaného pH...

• pK kyselin a bazí