Tipy a triky v HPLC: Příprava mobilní fáze v HPLC a její odvzdušnění a odplynění

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Příprava mobilní fáze v HPLC a její odvzdušnění a odplynění
Příprava mobilní fáze v HPLC
V mnoha případech problémy, které vznikají v chromatografickém systému, jsou způsobeny špatnou přípravou a užitím mobilní fáze. Problémy, které souvisí s přípravou a užitím mobilní fáze mohou být tyto:
- zavzdušněná hlava chromatografické pumpy (čerpadla)
- přítomnost vzduchových bublinek v cele detektoru
- nízká citlivost fluorimetrické detekce vlivem přítomného kyslíku v mobilní fázi
- nízká přesnost a reprodukovatelnost nástřiku vzorku
- zanesení in-line filtrů, frit nebo kapilár vlivem přítomných nečistot v mobilní fázi
Projevují zejména:
- zvýšeným tlakovým spádem na koloně
- zvýšeným šumem základní linie
- kolísavými retenčními časy (retenční čas je nereprodukovatelný)
- abnormálním profilem chromatografického píku
Při přípravě mobilní fáze se doporučují následující postupy:
-
Používat vždy čistá rozpouštědla, pokud možno co nejvyšší čistoty (HPLC grade). Toto platí i pro všechna aditiva (kyseliny, soli, báze) přidávaná do mobilní fáze.
-
Všechny připravené mobilní fáze filtrovat přes filtr 0,45 µm nebo menší (0,2 µm pro UPLC). Toto je zejména kritické při použití mobilních fází obsahující soli a pufry.
Je vhodné se ujistit, zda použitý filtr je kompatibilní s danou mobilní fází. Pro filtraci vodných roztoků se používají celulosové membránové filtry, pro filtraci organických a vodně-organických roztoků se používají teflonové membránové filtry (obecně fluoropolymery).
- Voda používaná k přípravě mobilní fáze musí být čistoty ultračistá nebo HPLC grade (vodivost menší než 0,5 µS). Kvalita vody je kritická zejména při použití gradientové eluce – nečistoty obsažené ve vodě se zadržují na koloně při použití mobilní fáze o malé eluční síle a se zvyšující se eluční silou mobilní fáze při gradientové eluci dochází k jejich vytěsnění z kolony.
Jako zcela nevhodné je použití pouze deionizované vody, která obsahuje organické nečistoty, které mohou pozměnit účinnost kolony, dochází k mikrobiologickému růstu na koloně. Při přípravě vody čistoty pro HPLC je možné používat deionizovanou vodu, která se následně destiluje s přídavkem manganistanu draselného.
Takto připravená voda se uchovává v chladnu a temnu se stříbrným drátkem na dně lahve z borátokřemičitanového skla. Tento postup se osvědčil v naší laboratoři.
Nevhodné je uchovávat vodu resp. mobilní fáze v plastických nádobách (polypropylenu, polyethylen) neboť dochází k uvolňování látek, použitých při výrobě plastu a dochází tak ke kontaminaci vody resp. mobilní fáze.
Při uchovávání vody nebo mobilní fáze ve skleněných nádobách je nutné mít na paměti, že:
- dochází k absorpci všech aditiv použitých při přípravě mobilní fáze na skleněný povrch a to různou rychlostí
- dochází k mikrobiologickému růstu
- dochází k uvolňování silikátů ze skla, které mají nepříznivý vliv na dané aplikace
Je vhodné si ověřit používané nádoby a zásobní lahve, zda nedochází při použití mobilní fáze k výše uvedeným jevům. Je vhodné používat k přípravě a uchovávání mobilní fáze stejné zásobní lahve. Před přípravou a uchováváním je vhodné vždy nádobu vypláchnou mobilní fází, není doporučeno používat k vymývání těchto nádob detergentů, které se adsorbují na povrch nádoby a mohou být vymývány mobilní fází a toto pak může vést k driftu na základní linii, zejména při gradientové eluci.
V případě použití detergentů k vymytí zásobních lahví se poté vymývají vodou čistoty HPLC a následně methanolem a vysuší se k suchu.
Umístění zásobníku mobilní fáze má být vždy výše, než vstup do chromatografické pumpy. K ověření správného umístění zásobníku mobilní fáze se otevře vypouštěcí ventil a mobilní fáze musí samovolně vytékat.
Odvzdušnění (degassing) mobilní fáze
Odvzdušnění a odplynění mobilní fáze je velmi důležitý krok při přípravě mobilní fáze, protože může odstranit většinu problémů vznikající při chromatografické analýze. Odvzdušnění mobilní fáze přináší řadu výhod:
- reprodukovatelné retenční časy
- stabilní průtok mobilní fáze
- nízký šum základní linie a vysokou citlivost u mnoha typů chromatografických detektorů (ECD, FLD).
K odvzdušnění mobilní fáze se používají čtyři metody, které se mohou vzájemně kombinovat:
- vakuová filtrace
- odvzdušnění na ultrazvukové lázni
- probublávání mobilní fáze heliem
- ohřev mobilní fáze (u velmi těkavých rozpouštědel je však tento způsob nepoužitelný)
- in-line vakuový degaser,
přičemž nejčastěji se v současné době používá in-line degaser, od ostatních způsobů se opouští z důvodu nízké účinnosti těchto postupů a jejich pracnosti.
Výhodou vakuové filtrace (podtlaková filtrace) při použití 0,45 µm filtru je i dokonalé zbavení mobilní fáze mechanických nečistot. Tento krok by neměl chybět při každé přípravě mobilní fáze.
Použití ultrazvukové lázně v kombinaci s vakuovým odsáváním je nejvhodnější kombinace (celková doba procedury by se měla pohybovat asi 20 minut pro 4 litry mobilní fáze), je nutná dbát na použití vhodných nádob při evakuaci, aby nedošlo k implozi nádoby.
V případě použití odplynění heliem dochází k rozpouštění plynu v mobilní fázi přičemž množství rozpuštěného plynu závisí na chemické afinitě plynu k danému rozpouštědlu, teplotě a tlaku. Helium se rozpouští snadněji v nepolárních rozpouštědlech než v polárních (větší rozpustnost bude v solventech používaných pro normální fázi).
Vliv teploty je složitější. V případě, že rozpouštěcí teplo je exotermické, rozpustnost plynu se snižuje se zvyšující se teplotou (helium ve vodě). V případě, že rozpouštěcí teplo je endotermické, rozpustnost plynu se zvyšuje se zvyšující se teplotou (helium v benzenu).
Vliv tlaku je jednoduchý a rozpustnost plynu v solventu stoupá se stoupajícím parciálním tlakem plynu (Henryho zákon, na tomto principu je založen vakuový degaser).
K zamezení vstupu mechanických nečistot do chromatografického systému je nutné použití in-line filtru mobilní fáze (kovový, teflon). Výběr filtru závisí na typu a použití mobilní fáze nebo činidel vstupující do chromatografického systému. Při použití oxidačně-redukčních látek jako činidel derivatizačních reakcí je žádoucí použití teflonových filtrů a vyhnutí se tak možným redoxním reakcím, které by mohly probíhat s kovovým filtrem. Použitý filtr by měl být vždy mechanicky nezávadný a čistý, aby nedocházelo k nereprodukovatelnému průtoku mobilní fáze chromatografickou pumpou.
Vakuový degaser
In-line vakuový degaser je založen na principu Henryho zákona který říká, že molární zlomek plynu rozpuštěného v kapalině je úměrný parciálnímu tlaku tohoto plynu v plynné fázi nad kapalinou (pB = kxB). Vakuový degaser je více či méně efektivní v závislosti na době solventu po kterou na něj působí snížený tlak.
Na účinnost vakuového degaseru působí dva faktory:
- průtok mobilní fáze (se zvyšujícím se průtokem klesá účinnost)
- ploše povrchu odplyňovací komory - délka PTFE membrány přes kterou probíhá odvzdušnění mobilní fáze je konstantní a zvýšením délky se zvyšuje účinnost.
Vakuový degaser může měnit složení binárních solventů. Odvzdušnění je rychlejší a ekonomičtější ve srovnání s odplyněním heliem. Nedochází k rozpouštění plynu v mobilní fázi.
Probublávání mobilní fáze heliem (sparging)
Při probublávání solventu heliem dochází k vytěsnění méně rozpustných plynů v mobilní fázi plynem rozpustnějším (heliem). Probublání solventu heliem udržuje solvent v ekvilibrovaném stavu, který se pak může udržovat již malým proudem helia nebo uchováním solventu „pod heliem“ (nedochází k opětovnému rozpouštění atmosferických plynů a současně se tak zamezuje mikrobiálnímu růstu). Použití této metody zpomaluje oxidaci solventů které přecházejí snadno na peroxidové formy (tetrahydrofuran).
Vakuová filtrace a sonikace
Vakuová filtrace snižuje tlak na povrchu solventu, bohužel samotné vakuum je příliš slabé a nedochází k dokonalému odplynění solventu. Může se kombinovat se sonikací za použití ultrazvukové lázně, kdy dochází k rozptýlení submikro-bublinek plynu, které se shlukují v solventu.