Tipy a triky v HPLC: Příprava mobilní fáze v HPLC a její odvzdušnění a odplynění

Příprava mobilní fáze v HPLC

V mnoha případech problémy, které vznikají v chromatografickém systému, jsou způsobeny špatnou přípravou a užitím mobilní fáze. Problémy, které souvisí s přípravou a užitím mobilní fáze mohou být tyto:

• zavzdušněná hlava chromatografické pumpy (čerpadla)
• přítomnost vzduchových bublinek v cele detektoru
• nízká citlivost fluorimetrické detekce vlivem přítomného kyslíku v mobilní fázi
• nízká přesnost a reprodukovatelnost nástřiku vzorku
• zanesení in-line filtrů, frit nebo kapilár vlivem přítomných nečistot v mobilní fázi

Projevují zejména:

• zvýšeným tlakovým spádem na koloně
• zvýšeným šumem základní linie
• kolísavými retenčními časy (retenční čas je nereprodukovatelný)
• abnormálním profilem chromatografického píku

Při přípravě mobilní fáze se doporučují následující postupy:

1. Používat vždy čistá rozpouštědla, pokud možno co nejvyšší čistoty (HPLC grade). Toto platí i pro všechna aditiva (kyseliny, soli, báze) přidávaná do mobilní fáze.

2. Všechny připravené mobilní fáze filtrovat přes filtr 0,45 µm nebo menší (0,2 µm pro UPLC). Toto je zejména kritické při použití mobilních fází obsahující soli a pufry.

Je vhodné se ujistit, zda použitý filtr je kompatibilní s danou mobilní fází. Pro filtraci vodných roztoků se používají celulosové membránové filtry, pro filtraci organických a vodně-organických roztoků se používají teflonové membránové filtry (obecně fluoropolymery).

3. Voda používaná k přípravě mobilní fáze musí být čistoty ultračistá nebo HPLC grade (vodivost menší než 0,5 µS). Kvalita vody je kritická zejména při použití gradientové eluce – nečistoty obsažené ve vodě se zadržují na koloně při použití mobilní fáze o malé eluční síle a se zvyšující se eluční silou mobilní fáze při gradientové eluci dochází k jejich vytěsnění z kolony.

Jako zcela nevhodné je použití pouze deionizované vody, která obsahuje organické nečistoty, které mohou pozměnit účinnost kolony, dochází k mikrobiologickému růstu na koloně. Při přípravě vody čistoty pro HPLC je možné používat deionizovanou vodu, která se následně destiluje s přídavkem manganistanu draselného.

Takto připravená voda se uchovává v chladnu a temnu se stříbrným drátkem na dně lahve z borátokřemičitanového skla. Tento postup se osvědčil v naší laboratoři.

Nevhodné je uchovávat vodu resp. mobilní fáze v plastických nádobách (polypropylenu, polyethylen) neboť dochází k uvolňování látek, použitých při výrobě plastu a dochází tak ke kontaminaci vody resp. mobilní fáze.

Při uchovávání vody nebo mobilní fáze ve skleněných nádobách je nutné mít na paměti, že:

• dochází k absorpci všech aditiv použitých při přípravě mobilní fáze na skleněný povrch a to různou rychlostí
• dochází k mikrobiologickému růstu
• dochází k uvolňování silikátů ze skla, které mají nepříznivý vliv na dané aplikace

Je vhodné si ověřit používané nádoby a zásobní lahve, zda nedochází při použití mobilní fáze k výše uvedeným jevům. Je vhodné používat k přípravě a uchovávání mobilní fáze stejné zásobní lahve. Před přípravou a uchováváním je vhodné vždy nádobu vypláchnou mobilní fází, není doporučeno používat k vymývání těchto nádob detergentů, které se adsorbují na povrch nádoby a mohou být vymývány mobilní fází a toto pak může vést k driftu na základní linii, zejména při gradientové eluci.

V případě použití detergentů k vymytí zásobních lahví se poté vymývají vodou čistoty HPLC a následně methanolem a vysuší se k suchu.

Umístění zásobníku mobilní fáze má být vždy výše, než vstup do chromatografické pumpy. K ověření správného umístění zásobníku mobilní fáze se otevře vypouštěcí ventil a mobilní fáze musí samovolně vytékat.

Odvzdušnění (degassing) mobilní fáze

Odvzdušnění a odplynění mobilní fáze je velmi důležitý krok při přípravě mobilní fáze, protože může odstranit většinu problémů vznikající při chromatografické analýze. Odvzdušnění mobilní fáze přináší řadu výhod:

• reprodukovatelné retenční časy
• stabilní průtok mobilní fáze
• nízký šum základní linie a vysokou citlivost u mnoha typů chromatografických detektorů (ECD, FLD).

K odvzdušnění mobilní fáze se používají čtyři metody, které se mohou vzájemně kombinovat:

• vakuová filtrace
• odvzdušnění na ultrazvukové lázni
• probublávání mobilní fáze heliem
• ohřev mobilní fáze (u velmi těkavých rozpouštědel je však tento způsob nepoužitelný)
• in-line vakuový degaser,

přičemž nejčastěji se v současné době používá in-line degaser, od ostatních způsobů se opouští z důvodu nízké účinnosti těchto postupů a jejich pracnosti.

Výhodou vakuové filtrace (podtlaková filtrace) při použití 0,45 µm filtru je i dokonalé zbavení mobilní fáze mechanických nečistot. Tento krok by neměl chybět při každé přípravě mobilní fáze.

Použití ultrazvukové lázně v kombinaci s vakuovým odsáváním je nejvhodnější kombinace (celková doba procedury by se měla pohybovat asi 20 minut pro 4 litry mobilní fáze), je nutná dbát na použití vhodných nádob při evakuaci, aby nedošlo k implozi nádoby.

V případě použití odplynění heliem dochází k rozpouštění plynu v mobilní fázi přičemž množství rozpuštěného plynu závisí na chemické afinitě plynu k danému rozpouštědlu, teplotě a tlaku. Helium se rozpouští snadněji v nepolárních rozpouštědlech než v polárních (větší rozpustnost bude v solventech používaných pro normální fázi).

Vliv teploty je složitější. V případě, že rozpouštěcí teplo je exotermické, rozpustnost plynu se snižuje se zvyšující se teplotou (helium ve vodě). V případě, že rozpouštěcí teplo je endotermické, rozpustnost plynu se zvyšuje se zvyšující se teplotou (helium v benzenu).

Vliv tlaku je jednoduchý a rozpustnost plynu v solventu stoupá se stoupajícím parciálním tlakem plynu (Henryho zákon, na tomto principu je založen vakuový degaser).

K zamezení vstupu mechanických nečistot do chromatografického systému je nutné použití in-line filtru mobilní fáze (kovový, teflon). Výběr filtru závisí na typu a použití mobilní fáze nebo činidel vstupující do chromatografického systému. Při použití oxidačně-redukčních látek jako činidel derivatizačních reakcí je žádoucí použití teflonových filtrů a vyhnutí se tak možným redoxním reakcím, které by mohly probíhat s kovovým filtrem. Použitý filtr by měl být vždy mechanicky nezávadný a čistý, aby nedocházelo k nereprodukovatelnému průtoku mobilní fáze chromatografickou pumpou.

Vakuový degaser

In-line vakuový degaser je založen na principu Henryho zákona který říká, že molární zlomek plynu rozpuštěného v kapalině je úměrný parciálnímu tlaku tohoto plynu v plynné fázi nad kapalinou (pB = kxB). Vakuový degaser je více či méně efektivní v závislosti na době solventu po kterou na něj působí snížený tlak.

Na účinnost vakuového degaseru působí dva faktory:

• průtok mobilní fáze (se zvyšujícím se průtokem klesá účinnost)
• ploše povrchu odplyňovací komory - délka PTFE membrány přes kterou probíhá odvzdušnění mobilní fáze je konstantní a zvýšením délky se zvyšuje účinnost.

Vakuový degaser může měnit složení binárních solventů. Odvzdušnění je rychlejší a ekonomičtější ve srovnání s odplyněním heliem. Nedochází k rozpouštění plynu v mobilní fázi.

Probublávání mobilní fáze heliem (sparging)

Při probublávání solventu heliem dochází k vytěsnění méně rozpustných plynů v mobilní fázi plynem rozpustnějším (heliem). Probublání solventu heliem udržuje solvent v ekvilibrovaném stavu, který se pak může udržovat již malým proudem helia nebo uchováním solventu „pod heliem“ (nedochází k opětovnému rozpouštění atmosferických plynů a současně se tak zamezuje mikrobiálnímu růstu). Použití této metody zpomaluje oxidaci solventů které přecházejí snadno na peroxidové formy (tetrahydrofuran).

Vakuová filtrace a sonikace

Vakuová filtrace snižuje tlak na povrchu solventu, bohužel samotné vakuum je příliš slabé a nedochází k dokonalému odplynění solventu. Může se kombinovat se sonikací za použití ultrazvukové lázně, kdy dochází k rozptýlení submikro-bublinek plynu, které se shlukují v solventu.