Simultánní stanovení vitaminu D₂ a D₃ v mléce

Vitamin D hraje důležitou roli v metabolických cestách, včetně homeostázy vápníku a fosforu, a je prekurzorem steroidních hormonů. Bohatým zdrojem vitaminu D jsou játra, ryby, vejce nebo mléčné výrobky. V některých rozvojových zemích jsou mléko a oleje na vaření, jako nákladově efektivní řešení prevence podvýživy, o vitamin D obohacovány. V rostlinách se nachází jako ergokalciferol (vitamin D₂) a u zvířat jako cholekalciferol (vitamin D₃).

Kvantitativní analýza založená na LC/MS/MS je pro kvantifikaci populárnější než tradiční analytické metody a to kvůli lepší specificitě a vyšší citlivosti. Analýza D₂ a D₃ v krmných směsích pro zvířata, potravinách rostlinného původu nebo potravinách o vitamin D obohacovaných uměle však čelí výzvám, jako je rychlá degradace a špatná reprodukovatelnost. Složitost analýzy se dále zvýšuje v důsledku rozmanitosti mléka a významným matricovžm efektům. Vyvinutá LC/QQQ metodika prokázala citlivost na úrovni 0,4 ng/g, má vysokou reprodukovatelnost a je vhodná nejen pro rutinní laboratoře, které tyto testy provádějí.

Struktura vitaminu D₂ a D₃

Úvod

Pro analýzu vitaminů D₂ a D₃ existuje řada publikovaných metod. Vzorky potravin s významnými matričními efekty se v LC/MS/MS analyzují pomocí APCI iontového zdroje. Přes veškeré úsilí ale představuje rozmanitost vzorků mléka s různým obsahem tuku pro analytická data potenciální hrozbu. Zmýdelnění ethanolickým hydroxidem draselným je důležité při manipulaci s proměnlivým poměrem tuků, zatímco přidání pyrogallolu je zásadní, aby se zabránilo oxidaci analytů během opakovaných kroků promývání. Derivatizace pomocí 4-fenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dionu (PTAD) je užitečná ke zvýšení citlivosti obou analytů, zatímco pro analýzu výtěžnosti je zásadní použití deuterovaných vnitřních standardů (IS).

Ředicí protokol pro přípravu standardů

Instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II High Speed Pump
• Agilent 1290 Infinity II vial sampler
• Agilent 1290 Infinity II MCT
• Agilent 6470 LC/TQ with AJS ion source

Parametry HPLC metody

• Kolona: Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (p/n 699975-302)
• Teplota kolony: 10 °C
• Objem nástřiku: 10 μL
• Teplota autosampleru: 10 °C
• Proplachovací roztok: Metanol/Voda (80/20)
• Mobilní fáze: A) 0,1% kyseliny mravenčí ve vodě; B) 100% methanol
• Průtok: 300 μL/min

Parametry LC/TQ systému

• Ionizační mód: AJS (+ ve)
• Nebulizační plyn: 45 psi
• Sušící plyn: 5 l/min při 300 °C
• Vyhřívací plyn: 11 l/min při 250 °C
• Napětí na kapiláře: 3500 V
• Napětí trysky: 500 V
• CAV: 5 V
• Dwell time: 50 ms
• Rozlišení: Unit/Unit

Parametry MRM pro analýzu vitaminu D₂ a D₃

Výsledky a diskuse

Vyvinutá metoda je vhodná pro kvantifikaci dvou forem vitaminu D: ergokalciferolu a cholekalciferolu. Bylo zjištěno, že metoda ESI-LC/MS/MS založená na MRM je specifická pro dva analyty v mléčné matrici. Kromě použití interních standardů se při sledování nízkých mezí detekce, vysoké citlivosti a vysoké výtěžnosti ukázala být užitečná příprava vzorků založená na zmýdelnění mléčné matrice s následnou derivatizací.

Příprava vzorků napříč různými typy mléka z trhu ukázala slušnou výtěžnost obou analytů. Tuto metodu mohou tedy použít výzkumné, kontrolní nebo komerční zkušební laboratoře pro kvantitativní odhad obsahu vitaminů D2 a D3 při obohacování potravit.

Citlivost analýzy vitamínů D₂ a D₃ (0,4 ppb v matrici oproti blanku)

Překrytí různých koncentrací vitamínů D₂ a D₃