A SYSTEMATIC APPROACH FOR PREVENTING THE LOSS OF HYDROPHOBIC PEPTIDES IN SAMPLE CONTAINERS

Význam tématu

LC-MS analýzy bílkovin a peptidů vyžadují precizní kontrolu přípravy vzorku, chromatografie i detekce. Často se opomíjí, že část analytů může během skladování v kontejneru nenávratně přiléhat na stěny nádoby, což vede ke zkreslení kvantitativních výsledků. Nespecifická vazba (NSB) tak snižuje citlivost, přesnost i reprodukovatelnost měření.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si klade za cíl identifikovat hlavní faktory vedoucí k NSB peptidů a navrhnout systematický postup, jak minimalizovat tyto ztráty bez použití blokovacích činidel. Autoři porovnávají různé materiály kontejnerů i vzorkových rozpouštědel a hodnotí vliv parametrů skladování na návratnost analytů.

Použitá metodika

Postup zahrnuje tři klíčové kroky:

• Výběr vhodného materiálu kontejneru s ohledem na iontové a hydrofobní interakce analytů.
• Optimalizace složení vzorkového rozpouštědla pro snížení adsorpce a zachování kompatibility s LC-MS.
• Stanovení ideálních podmínek skladování (teplota, doba), které nejméně ovlivňují návratnost peptidů.

Použitá instrumentace

Separační systém: ACQUITY UPLC I-Class s fixed loop injektorem. Mass spektrometr: Xevo TQ-S s univerzálním zdrojem. Kolona: CORTECS C18+ (90 Å, 1,6 µm, 2,1 × 50 mm) při 55 °C. Mobilní fáze: voda s 0,1 % kyseliny mravenčí (A) a acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí (B). Gradient 15–45 % B za 1,2 minuty, následný 95 % B wash a re-equilibrace. Objem injekce: 10 µl full loop.

Hlavní výsledky a diskuse

Hydrofobní peptidy byly zcela ztraceny v běžných skleněných i polypropylenových kontejnerech. Speciálně navržené QuanRecovery nádoby dosáhly výrazně vyšší návratnosti napříč testovanými peptidy, přičemž nejvýrazněji se projevilo zadržení melittinu. Úprava poměru vody a acetonitrilu ve vzorku modifikovala hydrofobní interakce, ale často omezila retenci na kolóně. Skladování v inertních nádobách QuanRecovery při pokojové teplotě zachovalo vysokou obnovu i po 47 hodinách, kdežto běžné nízkovazebné destičky selhávaly již při > 10 °C.

Přínosy a praktické využití metody

Systematický přístup nabízí:

• Eliminaci blokovacích činidel, která mohou interferovat s LC-MS detekcí.
• Univerzální kroky pro výběr kontejneru, rozpouštědla a skladovacích podmínek.
• Zvýšení přesnosti, citlivosti a reprodukovatelnosti kvantitativních LC-MS analýz bílkovin a peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj povrchových úprav a vývoj nových materiálů mohou dále snižovat NSB. Integrace tohoto protokolu do automatizovaných pracovních toků a jeho aplikace na různé biologické matrice (např. krevní séra) posílí spolehlivost vysoce propustných analýz.

Závěr

Systematický výběr kontejneru, optimalizace rozpouštědla a kontrola skladovacích podmínek efektivně předchází ztrátám peptidů způsobeným NSB. Implementace navrženého postupu přináší vyšší kvalitu kvantitativních LC-MS metod bez potřeby blokovacích aditiv.

Reference

1. M.C. Jung, Achieving Maximum Protein and Peptide Recovery, Sensitivity, and Reproducibility using QuanRecovery Vials and Plates, Waters White Paper, 720006543EN (2019)
2. Bobaly B., Sipko E., Fekete J., Challenges in liquid chromatographic characterization of proteins, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 1032, 3–22 (2016)
3. Rabe M., Verdes D., Seeger S., Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces, Adv Colloid Interface Sci 162, 87–106 (2011)