FACTORS THAT INFLUENCE THE RECOVERY OF HYDROPHOBIC PEPTIDES DURING LC-MS SAMPLE HANDLING

Význam tématu

Biomolekuly, zejména hydrofobní peptidy, se mohou během přípravy vzorků nevratně vázat na plochy vzorkových nádob. Tyto ztráty snižují citlivost, přesnost kvantifikace a reprodukovatelnost LC-MS analýz, což omezuje jejich robustnost v rutinní praxi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo identifikovat klíčové faktory (volba kontejneru, složení rozpouštědla, skladovací podmínky) ovlivňující recoverii hydrofobních peptidů bez použití blokujících aditiv a navrhnout systematický třístupňový postup minimalizace ztrát.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapalinová chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class s pevnou injekční smyčkou.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo TQ-S s univerzálním zdrojem.
• Kolona: CORTECS C18+, 90 Å, 1,6 µm, 2,1 × 50 mm při 55 °C.
• Podmínky: injekce 10 µL, tok 0,5 mL/min, gradient 15→45 % B za 1,2 min, 95 % B 0,5 min, reekvilibrace 0,6 min; fáze A 0,1 % kys. mravenčí ve vodě, fáze B 0,1 % kys. mravenčí v acetonitrilu.
• Příprava vzorků: peptidové roztoky bez a s 0,1 % potkaního plazmatického nosiče; varianty složení rozpouštědel (voda/acetonitril + 0,2 % TFA), koncentrace, doba a teplota skladování.

Hlavní výsledky a diskuse

• Krok 1 – Volba kontejneru: Sklol odvádí 100 % ztrátu hydrofobních peptidů. Polypropylen vykázal nízké návratnosti. Speciální vials a destičky navržené pro snížení hydrofobních interakcí dosáhly až 80–100 % recoverie.
• Krok 2 – Složení rozpouštědla: Vyšší podíl acetonitrilu snižuje hydrofobní adsorpci v polypropylenových nádobách, ale negativně ovlivňuje retenci peptidů na kolóně. Pouze pracoviště s QuanRecovery nádobami při zachování standardního rozpouštědla dosáhlo plné recoverie teriparatidu bez chromatografických kompromisů.
• Krok 3 – Skladovací podmínky: Peptidy ve standardních low-bind destičkách ztrácely až 50 % při teplotách nad 10 °C. Destičky QuanRecovery udržely >95 % recoverie i při 25 °C po 47 h.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti kvantitativních LC-MS analýz peptidů.
• Eliminace potřeby blokujících proteinových aditiv, která mohou interferovat v detekci.
• Možnost skladování vzorků v širším teplotním rozsahu bez ztrát.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových inertních a low-bind materiálů pro vzorkové kontejnery a analytické destičky.
• Integrace neadsorpčních povrchů přímo v proteomických a klinických workflow.
• Optimalizace postupu pro další třídy biomolekul (glykoproteiny, komplexní směsi peptidů).

Závěr

Systémový tříkrokový přístup (volba kontejneru, optimalizace rozpouštědla, kontrola skladovacích podmínek) významně redukuje ztráty hydrofobních peptidů bez blokujících aditiv, čímž zvyšuje kvalitu, citlivost a spolehlivost LC-MS analýz.

Reference

1. M.C. Jung a T.H. Walter, Achieving Maximum Protein and Peptide Recovery, Sensitivity, and Reproducibility using QuanRecovery Vials and Plates, Waters White Paper 720006543EN (2019).
2. Bobaly B., Sipko E. & Fekete J., Challenges in liquid chromatographic characterization of proteins, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 1032, 3–22 (2016).
3. Rabe M., Verdes D. & Seeger S., Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces, Adv Colloid Interface Sci 162, 87–106 (2011).