QUANTIFYING THE LIPIDOME FOR RESPIRATORYDISEASE: A RAPID AND COMPREHENSIVE HILIC-BASED TARGETED APPROACH

Význam tématu

Chronická respirační onemocnění, jako jsou CHOPN a astma, představují významnou zátěž pro zdravotní systém a pacienty. Analýza lipidového profilu (lipidomu) krve umožňuje odhalit molekulární změny spojené s těmito onemocněními, podpořit diagnostiku, monitorování stavu pacienta a vývoj nových terapeutických přístupů.

Cíle a přehled studie

Studie představuje vysoce propustnou a cílenou metodiku založenou na chromatografii HILIC v kombinaci s LC-MS/MS pro kvantifikaci více než 2000 lipidů. Hlavními cíli jsou:

• Rozdělení lipidů podle třídy pro snížení identifikační nejednoznačnosti
• Snížení počtu stabilně značených vnitřních standardů a tím nákladů
• Rychlá a robustní analýza vzorků plazmy pacientů s respiračními onemocněními

Použitá metodika

Vzorky plazmy byly připraveny jednoduchou precipitací bílkovin chlazeným isopropanolem (poměr 1:5) při teplotě 4 °C. Chromatografická separace využívá kolonu ACQUITY UPLC BEH Amide (2,1×100 mm, 1,7 µm) při 45 °C a gradientní eluci pomocí vodného roztoku s 10 mM octanem amonným a acetonitrilu. Analýza probíhá v režimu MRM s více než 2000 přechody založenými na fragmentech mastných kyselin a hlavičkových skupin.

Použitá instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY UPLC I-Class s injektorem FTN nebo Fixed Loop
• Kolona: ACQUITY UPLC BEH Amide, 2,1×100 mm, 1,7 µm
• Hmotové spektrometry: Xevo TQ-XS nebo Xevo TQ-S micro
• Ionizace: ESI v pozitivním i negativním režimu (2,8 kV/1,9 kV)
• Software: TargetLynx, LipidQuan Quanpedia, dále možnost zpracování v open-source Skyline

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající opakovatelnost retence (RSD < 2 %) při více než 1500 injekcích a mezi různými šaržemi kolony. Díky selektivním MRM přechodům vycházejícím z fragmentace mastných kyselin lze rozlišit isobarické lipidy, např. PC (16:0p/22:6) versus PC (18:2p/20:4). Statistická analýza dat (SIMCA-P+, MetaboAnalyst) odhalila odlišné lipidové profily mezi kontrolní skupinou, pacienty s CHOPN a astmatiky, včetně klíčových biomarkerů lipidových tříd a specifických molekul.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní workflow od přípravy vzorku až po biologickou interpretaci
• Redukce nákladů díky menšímu počtu značených standardů
• Vysoká specifita a citlivost cílené kvantifikace běžných plazmatických lipidů
• Rychlé zpracování dat s možností integrace do laboratorních rutin

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření cíleného lipidomického přístupu v klinických studiích, integrace s dalšími „omics“ daty a využití strojového učení pro hlubší biologickou interpretaci. Důležitým směrem je automatizace přípravy vzorků a otevřené softwarové platformy pro sdílení analytických metod.

Závěr

Popsaná HILIC-LC-MS/MS metoda nabízí robustní, citlivý a nákladově efektivní přístup k cílené kvantifikaci lipidů v plazmě pacientů s respiračními onemocněními. Díky redukci nejednoznačnosti identifikace a úspoře na standardech je vhodná pro široké nasazení v klinické a výzkumné praxi.

Reference

1. Munjoma N., Isaac G., Plumb R., Gethings L. (2019) Quantifying the Lipidome for a Respiratory Disease Study Using LipidQuan: A Rapid and Comprehensive Targeted Approach. Application Note 720006542EN.
2. Isaac G., Munjoma N., Gethings L., Plumb R. (2018) LipidQuan for Comprehensive and High-Throughput HILIC-based LC-MS/MS Targeted Lipid Quantitation. Application Note 720006402EN.