IMPROVING CONFIDENCE AND PRODUCTIVITY FOR N-LINKED GLYCAN ANALYSIS IN BIOTHERAPEUTICS DEVELOPMENT USING AN INTEGRATED UPLC-FLR-HRMS SYSTEM

Význam tématu

Glykozylace je klíčovým kvalitativním ukazatelem u bioterapeutik, neboť přímo ovlivňuje jejich účinnost, stabilitu a bezpečnost. Detailní charakterizace N-vázaných glykosidických struktur v průběhu vývoje a výroby bioléčiv zajišťuje konzistentní kvalitu a splnění regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo představit integrovaný systém BioAccord, složený z UPLC-FLR-TOF MS přístroje, a demonstrovat jeho aplikaci na analýzu uvolněných N-glykanů z infliximabu (innovátor vs. biosimilární produkt). Studie popisuje kompletní analytický postup od přípravy vzorků po automatizovanou identifikaci a reportování výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci glykosidických forem byla použita kolona ACQUITY Glycan BEH Amide (1,7 µm, 2,1 × 150 mm) při 60 °C na UPLC systému ACQUITY I-Class PLUS s detekcí FLR (λex 265 nm, λem 425 nm, 2 Hz).
Uvolněné glykany byly označeny soupravou RapiFluor-MS a připraveny automatizovaně na platformě Andrew Alliance.
Mass spectrometrická analýza probíhala na kompaktním TOF detektoru ACQUITY RDa v pozitivním režimu ESI, rozsah m/z 50–2000, se smartMSTM auto-kalibrací.

• LC systém: ACQUITY UPLC I-Class PLUS
• FLR detektor: ACQUITY FLR
• MS detektor: ACQUITY RDa (TOF MS)
• Software: UNIFI 1.9.4 s workflow Glycan FLR with MS confirmation
• Knihovna: RFMS glycan GU library (tolerance 0,2 GU) a hmotnostní tolerance 10 ppm

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný tok zpracování dat umožnil rychlou identifikaci glykosidických forem s využitím FLR chromatogramu kalibrovaného na glukózové jednotky (GU) a potvrzením přesné hmotnosti v MS. Integrace režimů nízké a vysoké energie (MS1 a MS2) zpřístupnila diagnostické fragmenty (např. m/z 528 pro α-1,3 galaktózu) k ověření isomerů FA2G2 vs. FA2G1Ga1.
Porovnání profilů inovátoru Remicade™ a biosimiláru Inflectra™ odhalilo zvýšený podíl glykanů obsahujících n-glykolylneuraminovou kyselinu (FA2G1Sg1) v biosimiláru.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší vysokou citlivost a strukturu-specifickou informaci díky kombinaci FLR a HRMS. Výsledný pracovní postup je robustní, snadno ovladatelný a vhodný pro rutinní nasazení v procesním vývoji i výrobě. Customizovatelné reporty usnadňují rychlou a konzistentní interpretaci dat mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Moderní analytické platformy budou stále více integrovat umělou inteligenci pro automatizovanou interpretaci spekter a prediktivní analýzu glykozylace.
Doplnění knihoven o širší spektrum glykanů a on-line monitoring glykozylace v reálném čase může dále zvýšit kontrolu kvality.
Miniaturizace přístrojů a paralelní multiomics přístupy umožní komplexní charakterizaci biologických vzorků s vyšší efektivitou.

Závěr

Integrovaný systém BioAccord UPLC-FLR-RDa usnadňuje a zrychluje analýzu uvolněných N-glykanů z bioterapeutik. Spolehlivá identifikace, jednoduchá obsluha a flexibilní reportování zajišťují vysokou produktivitu a důvěru v data při komparačních studiích innovátor vs. biosimilár.

Reference

1. Alley W. R. J., Yu Y. Q. Combining RapiFluor-MS and UNIFI Scientific Information System for a total N-linked glycan solution for innovator vs. biosimilar infliximab comparisons. Waters Application Note. 720005753EN. 2016
2. Yu Y. Q. A holistic workflow for acquiring, processing, and reporting fluorescent-labeled glycans. Waters Application Note. 720004619EN. 2016