Automated Glycan Assignment Using Mass Measurement with a Calibrated Retention Time in Glucose Unit

Význam tématu

Automatizovaná identifikace a kvantifikace N-glykanů je klíčová pro kontrolu kvality a srovnatelnost bioterapeutik, zejména při vývoji biosimilárních látek. Precizní stanovení glykoproteinových struktur ovlivňuje biologickou aktivitu, imunitní reakci pacienta a regulační schvalování.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat N-glykanový profil originálního infliximabu s kandidátem na biosimilární přípravek. Hlavními úkoly bylo:

• Stanovit glykanový profil inovátoru a biosimiláru.
• Vyhodnotit variabilitu mezi šaržemi.
• Ověřit srovnatelnost pomocí kalibrovaného retenčního času (Glucose Units, GU) a měření přesné hmotnosti.

Použitá metodika

Workflow zahrnovalo:

• Deglycosylaci pomocí PNGase F.
• Očištění glykánů HILIC 96-well destičkou.
• Značení 2-AB fluoroforem a následné odstranění přebytku značky.
• Separační HILIC-LC analýzu a detekci metodami FLR a QTof MS.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-class Bio s C18 HILIC BEH Glycan kolonkou (2.1 × 150 mm, 1.7 μm).
• FLR detektor (excitace 330 nm, emise 420 nm, 10 bodů/s, zesílení 10).
• Xevo G2-S QTof MS (ESI +, capilární napětí 2.75 kV, zdroj 100 °C, desolvatace 300 °C).
• UNIFI Biopharmaceutical Platform solution pro řízení sběru dat, bioinformatiku a reporting.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala významné rozdíly v glykoproteinovém profilu:

• Originální infliximab obsahoval imunogenní alfa(1,3)-gal a NeuGc glykany, které v biosimiláru chyběly.
• Batch-to-batch variabilita byla kvantifikována relativními procenty několika glykanů.
• Kalibrace retenčního času (GU) a přesná m/z data umožnily automatickou a spolehlivou asignaci více než 300 běžných N-glykanů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a automatizovaná workflow vhodná pro ne-i regulovaná laboratoře.
• Integrovaná analýza FLR a MS urychluje potvrzení glykanových struktur.
• Standardizované výsledky v GU umožňují porovnání mezi různými laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihoven glykanů a exoglykozidázových map pro zvýšení pokrytí vzorků.
• Integrace umělé inteligence pro rychlejší interpretaci dat.
• Vývoj absolutní kvantifikace glykanů pomocí interních standardů.
• Adaptace platformy pro vysokopropustné screeningové projekty.

Závěr

Uplatnění Biopharmaceutical Platform s UNIFI pro profilování N-glykanů infliximabu a jeho biosimilárního kandidáta ukázalo robustní, automatizované a reprodukovatelné řešení. Metoda umožňuje kvantitativní i kvalitativní hodnocení s vysokou citlivostí a přesností.

Reference

1. Waters Application note (720004202en).
2. Waters Application note (720004203en).