APPLICATION OF CYCLIC ION MOBILITY MASS SPECTROMETRY FOR HIGH PEAK CAPACITY SEPARATIONS OF NATIVE AND DEUTERATED PEPTIDE MIXTURES

Význam tématu

Analýza komplexních peptidových směsí vyžaduje vysokou rozlišovací schopnost při zachování rychlosti měření. Hybridní přístroje kombinující iontovou mobilitu s hmotnostní spektrometrií nabízejí dodatečnou dimenzi separace, která umožňuje zkrácení chromatografických časů a současné zvýšení kapacity vrcholů. Cyklická iontová mobilita (cIM) s možností vícenásobných průchodů přináší variabilní rozlišení až do~200 a otevírá prostor pro detailní studium peptidových vzorků včetně monitorování deuterace a konformačních stavů molekul.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl otestovat využití cIM-MS pro rychlé separace peptidových digestů a přímou infuzi, a dále sledovat retenci deuteria v peptidových a proteinových vzorcích během iontové mobility. Modelové systémy zahrnovaly tryptický digest enolázy, syntetický peptid P1 a myoglobin.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu byly použity dvě základní přístrojové konfigurace:

• Rapidní LC-MS: ACQUITY BEH C18 kolona 2,1×50 mm, 1,7 µm, gradient 1–90 % organiky za 3 minuty, průtok 0,6 mL/min.
• Infuzní režim: Hamilton stříkačka (250 µL) při 3 µL/min, vzorky chlazeny pro minimální back-exchange.

Hlavním měřícím přístrojem byl SELECT SERIES cIM-Q-ToF s cirkulačním IMS členem délky 98 cm. Mobility buffer byl dusík, kolizní plyn v pastičce a quadrupólu, helium v IMS vstupní oblasti. Počet průchodů cIM byl variován od 1 do 10 pro modulaci rozlišení.

Hlavní výsledky a diskuse

Multi-pass cIM výrazně zvýšilo kapacitu vrcholů a umožnilo plné oddělení četných peptidových izotopových shluků, které na LC-MS běhu nebo v jediném průchodu IMS zůstávají překryté. U peptidu P1 byl prokázán výskyt back-exchange pouze na postranních řetězcích během pobytu v cIM, zatímco kritická deuterace páteřních amidů byla zcela zachována i po 10 průchodech. Back-exchange experimetry odhalily, že přeměna deuteria na vodík probíhá přímo v IMS cyklu, nikoli v pastičce.

Přínosy a praktické využití metody

• Rapidní separace peptidů bez kompromisů v kapacitě vrcholů.
• Možnost infuze náročných vzorků srovnatelná s rychlým LC-MS.
• Detailní charakterizace HDX-MS experimentů s uchováním páteřní deuterace.
• Odhalování skrytých konformací intact proteinů prostřednictvím zpětné výměny deuteria.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření cIM metod pro:

• Integraci s top-down proteomikou a ion-mobilitními experiemnty v reálném čase.
• Rozšířené vícenásobné průchody pro vyšší rozlišení konformačních stavů.
• Vyvíjení gas-phase chemických reakcí v cyklickém IMS ke studiu proteinových interakcí.

Závěr

Cyklická iontová mobilita v kombinaci s TOF-MS přináší významné zvýšení separační kapacity a rozlišení komplexních peptidových i proteinových směsí. Umožňuje rychlé experimenty s minimální ztrátou deuteria na páteřních amidových vazbách a odhaluje nové konformace intact proteinů prostřednictvím selektivního back-exchange. Metoda má široké uplatnění v HDX-MS, proteomické analýze a studiu molekulárních konformací.

Reference

1 Palmer M. et al. Application of cyclic ion mobility mass spectrometry for high peak capacity separations of native and deuterated peptide mixtures. Waters Corporation, 2019.