Hydrogen Deuterium Exchange Coupled with SELECT SERIES Cyclic IMS Mass Spectrometer for Higher Workflow Efficiency

Význam tématu

Studium vyšší řádové struktury proteinů a jejich komplexů je klíčové pro pochopení mechanismů jejich funkce a vývoj terapeutických biomolekul. HDX-MS umožňuje sledovat dynamiku a flexibilitu proteinového řetězce, lokalizovat vazebná místa a změny konformace s vysokou propustností a nižšími náklady než techniky jako NMR, cryo-EM nebo rentgenová krystalografie.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat výkon nového masového spektrometru SELECT SERIES Cyclic IMS se systémy SYNAPT G2-Si a SYNAPT XS v aplikacích HDX-MS. Studie se zaměřila na citlivost, rozlišení hmotnosti a iontové mobility, dynamický rozsah detekce a schopnost pracovat s omezeným množstvím vzorku a zkrácenými chromatografickými gradienty.

Použitá metodika a instrumentace

Pro HDX byla použita standardní workflow: 1:20 inkorporace deuteria v pH 7, quench 1:1 v pH 2,4 při 0 °C, rychlá pepsinová digesce a LC-MS analýza při 0 °C. LC podmínky:

• Systém ACQUITY UPLC M-Class s HDX-2 automací
• Guard a analytický C18 BEH kolona (1 × 100 mm, 1,7 μm)
• Flow 40 μL/min, gradient 7 min, mobilní fáze A voda s 0,1 % FA, B acetonitril s 0,1 % FA

MS podmínky:

• SELECT SERIES Cyclic IMS v režimu HDMSE
• Ionizace ESI pozitivně, rozsah m/z 50–2000
• Kapitálové napětí 2,8 kV, kolizní energie 20–29 V, cone volt 30 V
• Dvojí průchod IMS, dual gain ADC detektor, StepWave XS

Software: MassLynx 1016, Quartz 2.4.1, PLGS 3.0.3, DynamX 3.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání tří systémů při analýze Phosphorylase B (32 μM) ukázalo identifikaci přibližně 240 peptide na SYNAPT G2-Si, 360 na SYNAPT XS a 560 na Cyclic IMS. Sekvenční pokrytí vzrostlo z 89 % (G2-Si) na 98,5 % (XS) a 100 % (Cyclic). Dvojí průchod IMS a dual gain ADC významně rozšířily dynamický rozsah a zlepšily přesnost měření izotopických distribucí u vysoce intenzivních iónů. Při nižších dávkách (40, 20 a 10 pmol) si Cyclic IMS zachoval sekvenční pokrytí nad 90 %, což dokládá schopnost práce se vzorkově omezenými proteiny.

Přínosy a praktické využití metody

Nový Cyclic IMS přináší:

• Více než o 30 % vyšší počet identifikovaných peptidů než předchozí generace
• 4× nižší požadavek na množství vzorku při zachování vysokého sekvenčního pokrytí
• Možnost zkrácení chromatografických gradientů a zvýšení denní propustnosti
• Přesnější kvantifikaci deuteria díky rozšířenému dynamickému rozsahu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší aplikace u komplexních vícesubunitních proteinů, další zkrácení chromatografických kroků a integrace s umělou inteligencí pro zrychlené vyhodnocení dat. Real-time HDX a kombinace s dalšími strukturálními metodami mohou dále rozšířit spektrum biologických aplikací.

Závěr

SELECT SERIES Cyclic IMS představuje významný krok vpřed v HDX-MS analýzách. Díky lepšímu rozlišení hmotnosti a iontové mobility, vyšší citlivosti a rozšířenému dynamickému rozsahu nabízí vyšší kvalitu dat, nižší spotřebu vzorků a větší laboratorní efektivitu.

Reference

1. Puchades C. et al. Epitope Mapping of Diverse Influenza Hemagglutinin Drug Candidates using HDX-MS. Sci Rep. 2019;9:4735.
2. Morrison L., Anderson M., Quinn C. Enhanced Performance of the SYNAPT XS and Its Impact on Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry Data Quality. Waters Technical Note. 720006870EN.
3. Sørensen L., Salbo R. Optimized Workflow for Selecting Peptides for HDX-MS Data Analyses. J Am Soc Mass Spectrom. 2018;29:2278–2281.