Hydrophilic Interaction Chromatography Method Development and Troubleshooting

Význam tématu

Analýza vysoce polárních sloučenin je v mnoha oblastech chemie a biochemie klíčová, avšak tradiční reverzní fáze HPLC a techniky jako derivatizace či iontové párování jsou nákladné a časově náročné. Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) přináší efektivní, reprodukovatelnou a vysoce citlivou separaci polárních neutrálních i nabitých spojů s využitím běžné HPLC instrumentace.

Cíle a přehled studie / článku

Technická publikace shrnuje principy HILIC, vývoj metodiky, optimalizaci provozních podmínek a postupy řešení problémů. Klíčovým cílem je ukázat, jak dosáhnout rychlého ustavení, úzkých špiček a vysoké reprodukovatelnosti i u „náročných“ polárních analytů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda staví na vytvoření tenkého vodního filmu na povrchu vysoce polární stacionární fáze a na inverzním vztahu polarity a retenční síly oproti reverzní fázi. Mobilní fáze kombinuje acetonitril (ACN) a vodné pufry (ammonium formate nebo acetate) v režimech izokratických či gradientních. Klíčové parametry:

• Stacionární fáze: InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (zwitteriontová), HILIC-OH5 (fruktanová), tradiční křemičná HILIC; ZORBAX RRHD HILIC Plus.
• Mobilní fáze: ACN:H2O 90:10 až 50:50 s 10–100 mmol l–1 NH4 formiátu/acetátu, pH 2,8–10,2.
• Podmínky eluce: gradienty 90→50 % B v 4–10 min nebo izokratické režimy 80–96 % B.
• Teplota: 25–40 °C a její vliv na selektivitu a efektivitu.
• Objem injekce: 1–5 µl v závislosti na rozměru kolony a složení injekčního rozpouštědla; vzorky se doporučují rozpouštět ideálně v ACN nebo zředit vodné roztoky v ACN.

Instrumentace:

• Vysokotlaké kapalinové chromatografy (HPLC/UHPLC).
• Kolonové moduly InfinityLab Poroshell (2,1×50–150 mm, částice 1,8–2,7 µm).
• Detektory: UV-Vis (210–260 nm), ESI-MS (Agilent 6490 QqQ, ESI+/-), ELSD, Refractive Index.
• Materiály: PEEK-línované spojky a kapiláry, HDPE lahve pro potlačení kovových artefaktů.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukázala, že retence v HILIC klesá s narůstajícím vodným podílem až k 50 % H2O, kde dochází k úplné desorpci. Malé změny obsahu ACN (±1–3 %) významně ovlivňují retenční časy. Zvýšení koncentrace pufru zlepšuje tvar špiček, avšak snižuje citlivost v MS a zvyšuje šum v ELSD. Pro oddělení kritických párů (např. Na+/Li+) je doporučováno silnější počáteční % B a jemnější gradienty (1–3 %/min).
Interakce polárních či nabitých metabolitů s aktivními místy na ocelovém povrchu vedou k odpadu signálu a širokým špičkám. Jednoduché passivační mytí 0,5 % kyselinou fosforečnou v 90:10 ACN:H2O a použití inertního hardware (PEEK-línování) jednoznačně obnoví výkon a dlouhodobou stabilitu.
Rychlé ustavování kolon vyžaduje alespoň 20 % vodné fáze; gradientní metody dosahují plné rovnováhy za 3–5 min, izokratiky při 4 % H2O potřebují 75 objemů kolony (~30 min).

Přínosy a praktické využití metody

HILIC umožňuje simultánní analýzu neutrálních, kationtů i aniontů v jednom běhu bez derivatizace, navíc srovnatelnou či lepší citlivostí v MS než reverzní fáze. Eliminují se nákladné kroky přípravy vzorku a derivatizace, přičemž se zachovává vysoká propustnost laboratoře a rychlost analýzy (~5–10 min). Metoda je vhodná pro farmaceutický výzkum (metabolity, vitaminy), environmentální monitoring (pesticidy, organofosfáty), biotechnologie (sacharidy, aminokyseliny) i QC/QA procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj HILIC směřuje k sub-2 µm částicím a kolonkám vhodným pro UHPLC a mikrofluidní aplikace, což přinese vyšší účinnost a nižší spotřebu rozpouštědel. Dále se očekává širší integrace s vysokorozlišujícími hmotnostními spektrometry a multidimenzionálními systémy (HILIC×RP), implementace AI-řízeného návrhu metod a využití zelených organických modifierů pro udržitelnější provoz.

Závěr

HILIC představuje univerzální, rychlou a citlivou techniku pro analýzu vysoce polárních látek na stávajících HPLC platformách. Klíčem k robustnímu provozu je správná volba stacionární fáze, optimalizace složení mobilní fáze a řešení interakcí s kovovým povrchem. Se zavedením jednoduchých passivačních postupů a inertního hardware lze dosáhnout vysoké reprodukovatelnosti a dlouhodobé stability.

Reference

Nenalezena žádná bibliografická literatura.