How Do I Choose? A guide to HPLC column selection

Význam tématu

Správná volba chromatografické kolony je zásadní pro dosažení vysoké účinnosti, optimální selektivity a požadovaného retence při kapalinové chromatografii. Moderní core–shell částice umožňují zkrátit dobu analýzy, snížit spotřebu rozpouštědel a zvýšit výkon přístrojů i při nižších tlakových nárocích.

Cíle a přehled článku

Článek poskytuje komplexní průvodce výběrem kolony od vysvětlení základních parametrů rozlišení (efektivita, selektivita, retence) až po detailní přehled dostupných fází Agilent InfinityLab Poroshell 120 a jejich srovnání s klasickými plně pórovitými částicemi (ZORBAX). Důraz je kladen na škálovatelnost metod mezi HPLC, UHPLC a Low Dispersion UHPLC.

Použitá metodika a instrumentace

Pro hodnocení rozlišení je využita standardní rovnice R_s = (1/4)√N·(α–1)/α·k/(1+k). Efektivita (N) roste s délkou kolony a klesající velikostí částic, selektivita (α) je ovlivněna jak stacionární, tak mobilní fází, retence (k) je významná zejména při nízkých hodnotách k. V ukázkových metodách byly použity:

• Agilent InfinityLab 1290/1260/1220 LC systémy (binární i kvaternární pumpy, Low Dispersion moduly)
• Detekce UV/VWD a LC–MS/MS (Agilent 6470, Ultivo TQ/MS ESI+, dMRM režimy)
• Column: Poroshell 120 ve velikostech částic 1,9; 2,7; 4 μm a vnitřních průměrech 2,1; 3,0; 4,6 mm, délky 50–250 mm
• Derivace karbonylů DNPH, analýza vitamínů, aminokyselin v HILIC režimu

Hlavní výsledky a diskuse

Superficially porous částice Poroshell 120 dosahují až 120 % efektivity oproti sub–2 μm plně pórovitým částicím při nižších tlacích. Portfolio EC-C18, SB-C18, HPH-C18, CS-C18 a řada alternativních fází (Phenyl-Hexyl, PFP, Bonus-RP, SB-Aq, HILIC-Z, HILIC-OH5) pokrývá široké pH (1–11) a typy analytů. Příkladné aplikace ukazují:

• Zrychlení separace aldehydů DNPH: z 14 min (HPLC) na 5,25 min (LD-UHPLC)
• Analýzu vitamínů B v 0,3 min oproti 36 min klasické metody s úsporou rozpouštědel až 98 %
• Separační výkon HILIC-Z pro vodou rozpustné vitamíny a aminokyseliny v jedné analýze
• Dobrou tvar špičky pro zásadité sloučeniny na CS-C18 i v přítomnosti kyseliny mravenčí

Přínosy a praktické využití metody

Implementace core–shell technologií zkracuje dobu analýz, zvyšuje počet vzorků na den a snižuje objem použitých rozpouštědel. Škálovatelnost metod mezi různými pumpami a rozměry kolony usnadňuje přenos analytických protokolů v rutiní praxi. Přesné řízení pH mobilní fáze nabízí silný nástroj pro optimalizaci retence ionizovatelných látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k integrovaným LC–MS řešením s automatizovaným návrhem metod, rozšíření portfolia alternativních stacionárních fází pro komplexní biopolymerní analýzy, kombinaci HILIC a RP v sériovém či dvourozměrném uspořádání a k udržitelnějším rozpouštědlům s nižší ekologickou zátěží.

Závěr

Komplexní přístup k výběru kolony zdůrazňuje význam tří klíčových parametrů rozlišení a nabízí uživatelům širokou škálu fází Agilent InfinityLab Poroshell 120 pro každou aplikaci. Díky moderní technologii core–shell a kompatibilitě se sérií InfinityLab LC lze dosáhnout vyššího výkonu, kratší doby analýzy a lepší reprodukovatelnosti.

Reference

• Agilent Technical Overview 5990-6588EN
• Agilent Application Note 5994-2095EN
• Agilent Application Note 5994-2274EN
• Agilent Application Note 5994-2358EN
• Agilent Application Note 5991-8922EN