Quantitative LC/MS/MS Analysis of Drugs in Human Serum With Agilent Captiva EMR–Lipid Cleanup

Význam tématu

Bioanalytická kvantifikace léčiv v biologických matricích vyžaduje účinné odstranění fosfolipidů, které mohou způsobovat iontovou supresi signálu, snižovat reprodukovatelnost měření a zkracovat životnost LC/MS/MS kolony a zdroje ionizace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit a porovnat výkon čištění vzorků lidského séra metodou protein precipitace (PPT) následovanou pass-through čištěním pomocí Agilent Captiva EMR–Lipid oproti samotné PPT a dalším lipid-čisticím produktům. Kvantifikace devíti reprezentativních léčiv byla prováděna na LC/MS/MS během jedné třídenní verifikační sekvence.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: in situ PPT (acetonitril s 1 % kyseliny mravenčí) v 96-well formátu následovaná pasivním čištěním na Agilent Captiva EMR–Lipid destičce.
• UHPLC: Agilent 1290 Infinity, kolona Poroshell 120 EC-C18 (150×2.1 mm, 2.7 µm), teplota 30 °C, průtok 0.3 mL/min, injekce 8 µL, mobilní fáze A 5 mM ammonium acetát/0.1 % FA, B 0.1 % FA v ACN, gradient 6→100 % B.
• MS/MS: Agilent 6490 Triple Quadrupole s Jet Stream iFunnel ESI, režim dMRM, teplota zdroje 120 °C, sheath gas 12 L/min, kapilární napětí 3000 V.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrační rozsah 0.5–200 ng/mL pro všech devět analýz: lineární křivky s R² > 0.99, přesnost 100 ±20 % (LLOQ) a ±15 % (ostatní úrovně), precize ≤20 % RSD (LLOQ) a ≤15 % (ostatní).
• Post column infusion studie prokázala výraznou iontovou supresi ve vzorcích připravených pouze PPT v retenčních zónách 1–2, 3.5–6 a 6.2–8 min. Po čištění Captiva EMR–Lipid byla suprese minimální a signál analyzátů stabilní.
• Batch-to-batch reproducibility sorbentu EMR–Lipid ukázala >99 % odstranění fosfolipidů a konzistentní recovery analytů mezi třemi výrobními šaržemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení spolehlivosti a reprodukovatelnosti kvantifikace malých molekul v lidské krvi.
• Snížení potřeby stabilně izotopových interních standardů díky vysoké čistotě extraktu.
• Nižší údržba LC/MS/MS přístrojů a prodloužení životnosti kolon a iontového zdroje.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření postupu na multikomponentní analýzy v potravinách, masech a dalších biologických matricích.
• Vývoj analogových interních standardů pro snížení nákladů a zjednodušení validací.
• Kompletní automatizace 96-well workflow pro vyšší propustnost v klinických a průmyslových laboratořích.

Závěr

Použití Agilent Captiva EMR–Lipid po protein precipitaci významně zlepšuje kvalitu vzorků pro LC/MS/MS, minimalizuje iontovou supresi, splňuje přísné validní kritéria a umožňuje spolehlivou kvantifikaci devíti léčiv v lidské séru s vysokou přesností, precizí a reprodukovatelností.

Reference

• US FDA Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, 2001.
• Bylda C., Thiele R. Recent advances in sample preparation techniques to overcome difficulties in quantitative analysis of small molecules from biofluids using LC-MS/MS. Analyst 2014, 139, 2265–2276.
• León Z. et al. Solid-phase extraction LC-MS/MS for determination of 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone and metabolites in urine and semen. Anal Bioanal Chem 2010, 398, 831–843.
• Mulvana D.E. Critical topics in ensuring data quality in bioanalytical LC-MS method development. Bioanalysis 2010, 2, 1051–1072.
• Michopoulos F. et al. Extraction methods for removal of phospholipids and other endogenous material from biological fluids. Bioanalysis 2011, 3, 2747–2755.
• Zhao L., Lucas D. Efficiency of Biological Fluid Matrix Removal using Captiva EMR–Lipid Cleanup. Agilent Technologies Application Note 5991-8006EN, 2017.
• Bonfiglio R. et al. The effects of sample preparation methods on variability of ESI response for model drug compounds. Rapid Commun Mass Spectrom 1999, 13, 1175–1185.