A Comprehensive Workflow for a Large Panel of Drugs of Abuse in Human Whole Blood by LC/MS/MS

Význam tématu

Forenzní toxikologie se potýká s rostoucím počtem nových i klasických látek zneužívaných v populaci. Spolehlivá a rychlá kvantifikace těchto látek v krvi je zásadní jak pro soudní expertizy, tak pro klinické a kriminalistické aplikace. Účinné odstranění proteinů i lipidů z biologické matrice zlepšuje citlivost metody, snižuje iontové rušení a prodlužuje intervaly mezi údržbou hmotnostního spektrometru.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit robustní workflow pro kvantitativní stanovení 67 běžných drog a jejich metabolitů v lidské plné krvi. Klíčovým prvkem bylo použití Agilent Captiva EMR–Lipid 6mL kazet s integrovaným srážením proteinů a následným čištěním lipidů. Metoda byla navržena pro objem vzorku 1 mL, jak je obvyklé v forenzních laboratořích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly nejprve připraveny in-kazetovou precipitací proteinů pomocí studeného acetronitrilu/methanolu. Následovalo čištění lipidů na sorbentu EMR–Lipid, které odstranilo více než 99 % fosfolipidů. Suchý extrakt byl rekonstituován v ammoniumacetátovém pufru a filtrován přes Captiva RC 0,2 μm. Analýza probíhala na systému Agilent 1290 Infinity LC spojeném s triplekvadrupólem G6490A s iFunnel ESI. Použity byly mobilní fáze s 10 mM ammoniumacetátem a 0,125 % kyselinou formiovou ve vodě (A) a ve směsi acetonitril/voda (95/5, B), gradientní eluce v čase 11 minut, tok 0,4–0,5 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla limitů kvantifikace 0,5–1 ng/mL pro většinu látek (pro fentanyl 0,05 ng/mL). Lineární kalibrace v rozsahu 0,5–50 ng/mL (některé analyty 5–250 ng/mL) vykazovaly koeficient R2 > 0,99. Obnovitelnost látek se pohybovala mezi 60 a 120 % pro více než 95 % analytů, repoduktibilita byla ≤ 20 % RSD. Selektivita byla potvrzena na matricových blank vzorcích, nesignifikantní carry-over a nízké matrice iontů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká efektivita odstraňování fosfolipidů a proteinů
• Minimalizace iontového rušení a snižování kontaminace systému
• Podpora velkého objemu vzorku (1 mL) běžného v forenzních laboratořích
• Široké spektrum 67 drog a metabolitů v jediném běhu
• Zrychlený workflow a snížené náklady na údržbu zařízení

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj může směřovat k automatizaci přípravy vzorků, miniaturizaci sorpčního formátu, rozšíření panelu o nové psychoaktivní látky a implementaci vysoce rozlišených hmotnostních spektrometrů pro neadresné screenování. Integrace dat do hlavních laboratorních informačních systémů a využití umělé inteligence pro rychlé vyhodnocení chromatogramů dále zvýší efektivitu forenzních analýz.

Závěr

Použití in-kazetové precipitace proteinů a následného EMR–Lipid čištění poskytuje spolehlivou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro kvantifikaci rozsáhlého panelu drog v lidské krvi. Výsledný protokol zvyšuje throughput, snižuje provozní náklady a zajišťuje robustní analýzu pro forenzní i klinické prostředí.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC (G4220A, G4226A, G1316C)
• Agilent G6490A triplekvadrupól LC/MS s Jet Stream iFunnel
• Agilent Captiva EMR–Lipid 6 mL kazety a Captiva RC 0,2 μm filtry
• PPM-48 pozitivní tlakový manifold
• SPE TurboVap odpařovač

Reference

1. Mali N. et al. A Review on Biological Matrices and Analytical Methods Used for Determination of Drug of Abuse; J. Applied Pharmaceutical Science 2011, 06, 58–65.
2. Saito K. et al. Analysis of Drugs of Abuse in Biological Specimens; J. Health Science 2011, 57(6), 472–487.
3. Moeller M.R., Steinmeyer S., Krämer T. Determination of Drugs of Abuse in Blood; J. Chromatography B 1998, 713, 91–109.
4. Zhao L. Quantitative Determination of Drugs of Abuse in Human Whole Blood by LC/MS/MS Using Agilent Captiva EMR–Lipid Cleanup; Agilent Technologies Application Note 5991-9251EN, 2018.
5. Zhao L. Quantitative Determination of Drugs of Abuse in Human Plasma and Serum by LC/MS/MS Using Agilent Captiva EMR–Lipid Cleanup; Agilent Technologies Application Note 5991-9312EN, 2018.
6. Zhao L., Jones M. Protein Precipitation for Biological Fluid Samples Using Agilent Captiva EMR–Lipid 96-well Plates; Agilent Technologies Application Note 5991-9222EN, 2018.